Ключевые слова
мышечные белки человека, мышечные белки сельскохозяйственных животных, протеомика, протеомные базы данных, молекулярные основы полиморфизма белков, белковые биомаркеры злокачественных опухолей, клеточные модели, клеточные биотест-системы

Направления исследований

• Системные исследования белков мышечных органов человека и некоторых других млекопитающих (сельскохозяйственных животных) с использованием протеомной стратегии, имеющие целями получение характерных протеомных профилей мышечных тканей, поиски новых мышечных белков, а также выявление белков — маркеров различных патологических процессов в мышечных органах;
• Системные исследования белков в мясных продуктах, включая функциональные, с использованием протеомной стратегии, имеющие целями создание методов контроля качества и выявления белков немышечного происхождения, в том числе свидетельствующих о фальсификации мясных продуктов;
• Изучение механизмов биохимического полиморфизма белков (полилокусность, полиаллелизм, постсинтетические модификации) и роли полиморфных изоформ в функционировании мышечных органов человека, как норме, так и при патологии;
• Построение протеомных баз данных, включающих сведения о мышечных белках человека и ряда сельскохозяйственных животных;
• Создание и расширение коллекции культур клеток человека для использования их как клеточных моделей при изучении биохимических механизмов клеточной дифференцировки и действия различных ростовых факторов, а также потенциальных лекарственных препаратов

Основные методы исследований
В рамках фундаментальных и прикладных исследований белков человека, а также некоторых сельскохозяйственных животных лаборатория применяет полный набор протеомных технологий, который включает:

• высокоэффективные методы фракционирования и идентификации белков;
• методы сравнительного анализа протеомных профилей различных биоматериалов (образцов тканей мышечных органов, а также  изготовленных из них пищевых продуктов и культивируемых клеточных линий);
• методы определения белков с некоторыми постсинтетическими модификациями (фосфорилирование и гликозилирование);
• биоинформационные технологии с формированием протеомных баз данных.

В качестве высокоэффективные методы фракционирования белков применяются традиционные модификации двумерного электрофореза по О’Фарреллу с использованием как амфолиновых, так  и иммобилиновых градиентов pH при изоэлектрическом фокусировании, а также оригинальная собственная модификация, позволяющая параллельно анализировать белки с «кислыми» и «основными» значениями pI. Визуализация белковых фракций на двумерных электрофореграммах осуществляется с помощью традиционных красителей (включая флуоресцентные), а также методом серебрения.

Идентификация белковых фракций на двумерных электрофореграммах выполняется разными традиционными методами от коэлектрофореза и  иммуноблоттинга до современных модификаций масс-спектрометрического анализа. Последние технологии являются основными. Наиболее широко применяется лазерная десорбция триптических пептидов (полученных из белковых фракций) в сочетании с время-пролетной масс-спектрометрией. (Технология MALDI-MS – matrix-assisted laser-desorption ionization – mass spectrometry, предусматривающая биоинформационную расшифровку масс-спектров с помощью специализированной программы Mascot). Кроме того, используется также так называемая тандемная масс-спектрометрия, которая позволяет непосредственно расшифровывать аминокислотные последовательности анализируемых пептидов.

Для сравнительного анализа протеомных профилей различных биоматериалов соответствующие двумерные электрофореграммы сканируют, получают их отцифрованные изображения, которые сравнивают с помощью специального пакета компьютерных программ анализа изображений (ImageMaster 2D Platinum 7.0, фирма «Genebio», Швейцария). Кроме того, при сравнительном протеомном анализе применяется флуоресцентный двумерный дифференциальный электрофорез в геле (fluorescent two-dimensional difference gel electrophoresis, 2-D DIGE). Достоинством 2-D DIGE является способность прецизионно выявлять различия между двумя группами анализируемых препаратов за счет использования коэлектрофореза двух сравниваемых проб, меченных  разными флуоресцентными красителями.

Методы определения фосфорилированных или гликозилированных белков включали их аффинное связывание на специальных коммерческих сорбентах (например, «Phosphoprotein Purification Kit» фирмы Qiagen) с последующим фракционированием сорбированных белков двумерным электрофорезом.

При построении протеомных баз данных использовались пакеты программ, включавшие MapThis!, Molly Pinguin Software, а также другие программные средства, в частности, входящие в набор Microsoft Office. На промежуточном этапе многоуровневые протеомные базы данных формировались на основе СУБД MySQL с соответствующей WEB-структурой, позволяющей в режиме «on-line» вносить и редактировать данные с любого компьютера, подключенного к сети Интернет. Далее осуществлялись работы по внесению полученных экспериментальных данных для каждого идентифицированного белка в специально созданные поля записи второго информационного уровня, сбор литературной информации для полей третьего уровня и установление прямых интернет-ссылок, связывающих описание белка в создаваемой базе данных с соответствующими записями в публичных базах данных NCBI и UniProt.

В фундаментальных и прикладных исследованиях белкового полиморфизма применялся также ряд ДНК-технологий, включая мультиплексную полимеразную цепную реакцию, метод определения конформационного одноцепочечного полиморфизма (SSCP-анализ), полимеразную цепную реакцию в реальном времени и ДНК-секвенирование коротких ДНК-фрагментов для идентификации полиморфных сайтов.

Для решения различных прикладных задач в лаборатории используются также методы иммуноферментного анализа (например, ELISA при клинических исследованиях потенциальных белковых биомаркеров), а также специально разработанные клеточные биотест-системы для определения функциональной активности ростовых факторов и других биологически активных веществ.

Краткая история лаборатории
Лаборатория биомедицинских исследований была сформирована в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН в 2002 году в связи с переходом группы ведущих сотрудников лаборатории биохимической генетики Медико-генетического научного центра РАМН. Возглавил эту новую лабораторию в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН д.б.н., проф. С.С. Шишкин, который ранее (с 1982 г.) руководил лабораторией биохимической генетики Медико-генетического научного центра РАМН.

В первый состав лаборатории вошли шесть сотрудников (вместе с заведующим), среди которых были д.б.н. Ковалев Л.И., к.б.н. Крахмалева И.Н., к.б.н. Ковалева М.А. Двое из них, д.б.н. Ковалев Л.И. и д.б.н. Ковалева М.А. (которая подготовила докторскую диссертацию и защитила ее в 2013 г.) продолжают работать в лаборатории. К сожалению, из состава лаборатории в 2013 г. в связи со смертью выбыла к.б.н. Крахмалева, которая успешно работала даже во время своей тяжелой болезни. В настоящее время в состав лаборатории входят ещё три научных сотрудника (Еремина Л.С., Лисицкая К.В., Иванов А.В.). Все они являлись аспирантами, подготовили и защитили свои кандидатские диссертации по результатам исследований, выполненных в лаборатории биомедицинских исследований ИНБИ.

Основная тематика НИР сначала включала различные аспекты изучения мышечных белков человека в норме, в ходе индивидуального развития, а также при различных видах патологии. Соответствующие плановые и различные договорные исследования по данной тематике выполнялись с использованием протеомных и некоторых других постгеномных технологий. Так, в период 2003-2006 гг. в лаборатории осуществлялись работы по изучению дифференцировки культивируемых мышечных клеток человека с акцентом на выяснение роли генетического контроля и отдельных средовых факторов, а также проводились исследования органо- и тканеспецифичности сарколеммных и цитоскелетных белков мышц в онтогенезе. При этом по заданиям Федеральной целевой научно-технической программы. Технологии живых систем «Медико-биологические технологии повышения работоспособности в экстремальных условиях» был выполнен цикл работ по изучению влияния полиморфизма отдельных мышечных белков на показатели работоспособности у спортсменов, а также по созданию клеточных биотест-систем для определения функциональной активности миостатина, изоформ инсулино-подобного фактора 1 и ряда других биологически активных соединений.

В период 2005-2012 гг. научная тематика лаборатории расширилась, сотрудники наряду с исследованиями мышечных белков значительное внимание стали уделять различным немышечным белкам, вовлеченным в обеспечение клеточной подвижности, и их возможного участия в трансформации нормальных клеток в злокачественные. В указанный период сотрудниками лаборатории был выполнен ряд договорных работ, в том числе и по Государственным контрактам, направленным на поиск и изучение новых биомаркеров злокачественных опухолей простаты с использованием протеомных и других постгеномных технологий. Ряд результатов, полученных в ходе этих исследований, имели приоритетный характер. Они нашли отражение в созданной отечественной общедоступной базе данных «Протеомика рака простаты», которая была включена в Государственный реестр баз данных (регистрационный номер 2012620676 от 13.07.2012). Кроме того, на один из выявленных потенциальных биомаркеров был получен соответствующий патент (№ 2360924, зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 10 июля 2009 г.).

С 2012 года благодаря сотрудничеству с ФГБНУ Всероссийский научно-исследовательский институт мясной промышленности им. В.М. Горбатова (ВНИИМП им. В.М. Горбатова) в научной тематике лаборатории значительное место заняли протеомные исследования белков ряда сельскохозяйственных животных и различных мясных продуктов, включая функциональные мясные продукты. Как следствие собранные за много лет материалы исследований мышечных белков человека, а также сведения о белках указанных сельскохозяйственных животных были объединены в ещё одной отечественной базе данных «Протеомика мышечных органов». При этом к настоящему времени результаты, выполненных протеомных исследований мышц сельскохозяйственных животных, открыли путь к созданию высокочувствительных технологий контроля качества мясных продуктов питания на основе анализов  видоспецифических изоформ ряда мышечных белков.

ОСНОВНЫЕ ДОСТИЖЕНИЯ

В результате протеомных исследований тканей мышечных органов и культивируемых клеток человека было идентифицировано и охарактеризовано по ряду биохимических параметров более 500 белков человека. Полученные материалы стали основой для построения оригинальной отечественной общедоступной базы данных «Протеомика мышечных органов». Эта база данных зарегистрирована в Государственном реестре баз данных (регистрационный номер 2013620315 от 20.02.2013) и размещена на сайте Института биохимии им. А.Н. Баха РАН (http://mp.inbi.ras.ru). Среди охарактеризованных белков выявлены изоформы, представляющие собой   различные проявления биохимического полиморфизма, которые, в частности, обусловлены единичными аминокислотными заменами, например, новый вариант триозофосфатизомеразы 1 (единичная аминокислотная замена 233G®D). Кроме того, полученные результаты позволили разрешить в одну из сторон так называемые «конфликтные» определения (по 135 позициям) в аминокислотных последовательностях 59 белков человека, которые приведены в международной базе данных UniProt.

Одним из достижений данного цикла исследований стало обнаружение множественности изоформ трансгелина по результатам сравнительных протеомных исследований трех органов человека, содержащих гладкомышечные волокна (миометрий, аорта и простата). Обнаруженные изоформы  могут рассматриваться как потенциальные тканеспецифичные биомаркеры. Кроме того, удалось выявить несколько потенциальных белковых маркеров пренатальных и постнатальных стадий онтогенеза, а также продемонстрировать в модельных клеточных культурах изменения продукции b-тропомиозина и белка S100A11, связанные с клеточной дифференцировкой.

Значимым результатом изучения полиморфизма мышечных белков человека стало также установление ассоциации со способностью к высоким физическим нагрузкам присутствие разных аллелей a-актинина 3, вызванных однонуклеотидной заменой, которая приводит к появлению преждевременного стоп-кодона (R577X гена ACTN3). Так, сравнительный анализ распределения генотипов и частот аллелей для полиморфизма  R577X гена ACTN3 в представительной выборке этнических русских и в группе элитных спортсменов РФ показал, что среди элитных спортсменов в целом увеличено присутствие лиц с генотипом RR и снижено — с генотипом XX; обнаруженные различия оказались наиболее выраженными в подгруппах пловцов и лыжников, что позволяет рекомендовать учитывать результаты генотипирования по данному полиморфизму при определении специализации молодых спортсменов. В ходе этих работ была собрана представительная коллекция образцов ДНК спортсменов, а также лиц, не занимающихся спортом, и пациентов с наследственными нервно-мышечными заболеваниями.

Продолжением протеомных исследований тканей мышечных органов человека стали аналогичные исследования мышечных тканей некоторых видов сельскохозяйственных животных (свиней, коров, лошадей). В результате было идентифицировано и охарактеризовано по ряду биохимических параметров около 250 мышечных белков этих животных. В частности протеомные исследования белков в разных препаратах конины привели в целом к идентификации 85 белковых фракций. При этом был получен целый ряд новых прямых данных о лошадиных белках, существование которых ранее только предсказывалось по материалам исследования кодирующих нуклеиновых кислот, полученных при изучении вида Equus caballus. Собранные материалы о белках указанных сельскохозяйственных животных были включены в базу данных «Протеомика мышечных органов», количество белков в которой превысило 750. В целом, результаты протеомных исследований мышц сельскохозяйственных животных открыли путь к созданию высокочувствительных технологий контроля качества мясных продуктов питания на основе анализов  видоспецифических изоформ ряда мышечных белков.

Ключевым достижением другого направления протеомных исследований, связанных с изучением белков в раковых опухолях простаты и соответствующих культивируемых клеточных линиях, можно считать создание еще одной отечественной общедоступной базы данных «Протеомика рака простаты». Эта база данных зарегистрирована в Государственном реестре баз данных (регистрационный номер 2012620676 от 13.07.2012) и размещена на сайте Института биохимии им. А.Н. Баха РАН (http://ef.inbi.ras.ru). В неё вошли материалы более чем о 600 белках, которые были идентифицированы в биоптатах тканей простаты со злокачественными и доброкачественными опухолями, а также в ряде клеточных линий человека, моделирующих аденокарциномы и саркомы урогенитальных органов. В ходе этого цикла работ было обнаружено несколько безымянных, гипотетических и других малоизученных белков человека, в том числе пять безымянных белков (продукты локусов BAC05360, BAG63245, BAH11721, BAG53005, BAC05009, зарегистрированных в GenBank), а также семь укороченных белковых продуктов, предсказанных ранее по материалам исследований геномной ДНК и/или соответствующих мРНК.

Проведенные в ходе этого направления поиски потенциальных биомаркеров злокачественных опухолей простаты принесли ряд результатов, которые могут найти применение в диагностике. Так, было показано, что наиболее перспективными для применения в качестве биомаркеров являются белки AGR-2 и Dj-1. В пользу этого заключения свидетельствовали, в частности, и результаты иммуноферментного анализа белка Dj-1, которые показали статистически достоверные различия в сывороточном содержании Dj-1между группами больных раком и гиперплазией предстательной железы.

К основным достижениям можно отнести также разработки и использование четырех клеточных биотест-систем, которые были созданы  на основе активно пролиферирующих культивируемых клеток человека, включая линии злокачественных клеток. Эти системы позволяют определять функциональные свойства активности некоторых ростовых факторов и других биологически активных веществ.

В лаборатории постоянно ведется работа по подготовке молодых специалистов, и за 16 лет существования Лаборатории по тематике исследований были защищены одна докторская и семь кандидатских диссертаций

СОСТАВ ЛАБОРАТОРИИ

ИННОВАЦИОННЫЕ РАЗРАБОТКИ

УНИКАЛЬНОЕ ОБОРУДОВАНИЕ

1. Протеомный анализ белкового состава различных биоматериалов человека
2. Протеомный анализ белкового состава различных видов мясного сырья и мясных пищевых продуктов
3. Определение функциональной активности (стимулирующей или подавляющей клеточную пролиферацию) новых биологически активных веществ с помощью специально разработанных клеточных биотест-систем.