Группа генной инженерии низших эукариот

Агафонов Михаил Олегович
Руководитель группы
кандидат биологических наук
ИНБИ, корп. 2, комн. 304
Телефон +7 (495) 954-40-97 доб. 454
E-Mail  agaphonov@inbi.ras.ru

Основное

ОПИСАНИЕ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ЛАБОРАТОРИИ

Ключевые слова
д
рожжи, метилотрофы, Hansenula (Ogataea) polymorpha, секреция белков, гликозилирование белков в секреторном пути, секреторные органеллы, укладка белков в секреторном пути, гомеостаз кальция в клетках, гомеостаз фосфата, рекомбинантные белки, редактирование генома

Направления исследований
Основные направления работы группы связаны с изучением работы секреторных органелл клетки на модели метилотрофных дрожжей Ogataea polymorpha и O. parapolymorpha. Одним из таких направлений является изучение роли гликозилирования белков в секреторном пути в регуляции физиологии клетки. От гликозилирования белков в секреторном пути зависит большое количество процессов в клетке: укладка белков в эндоплазматическом ретикулуме, поддержание целостности клеточной стенки, стабильность множества белков плазмалеммы, связанных с транспортом различных ионов и метаболитов, а также с восприятием сигналов о целостности клеточной стенки и об изменении условий окружающей среды. Если роль присоединения гликозидов к полипептидным цепям белков в эндоплазматическом ретикулуме к настоящему моменту, в существенной степени, стала понятной, то биологическое значение модификаций гликозидов в аппарате Гольджи остается малоизученным. Поэтому изучение проявлений различных нарушений гликозилирования в аппарате Гольджи является одним из приоритетных направлений работы группы.

Кроме этого, группа занимается разработкой подходов для получения высокоэффективных продуцентов рекомбинантных белков, пригодных для промышленного использования, на основе дрожжей O. polymorpha и O. parapolymorpha.

Основные методы исследований
Методы генетической инженерии и молекулярной генетики дрожжей, различные биохимические методы.

Краткая история группа
Группа генной инженерии низших эукариот была сформирована в 2019 году под руководством к.б.н. Агафонова Михаила Олеговича.

Достижения

ОСНОВНЫЕ ДОСТИЖЕНИЯ

При изучении секреции активатора плазминогена урокиназного типа человека (urokinase-type plasminogen activatior, uPA) клетками дрожжей Ogataea polymorpha и O. parapolymorpha было показано, что этот белок неэффективно принимает правильную конформацию в секреторном пути дрожжей, что при высоком уровне экспрессии приводит к его накоплению внутри клеток в форме высокомолекулярных агрегатов. Был идентифицирован ряд геномных мутаций, улучшающих укладку uPA и за счет этого увеличивающих эффективность секреции этого белка. В частности, было обнаружено, что такой фенотип вызывают некоторые мутации, нарушающие гликозилирование белков в секреторном пути. Нарушение С-концевого домена альфа-субъединицы окаймляющего комплекса COPI (альфа-СОР) приводило к увеличению секреции uPA не только из-за улучшения укладки этого белка, но и из-за нарушения распознавания и задержи его неправильно уложенных молекул. Кроме того, нарушение С-концевого домена альфа-СОР приводила к чувствительности клеток к недостатку кальция в среде. Дальнейшее изучение этой мутации и ее взаимодействия с нарушениями кальциевых АТФаз аппарата Гольджи и вакуоли показало, что компоненты комплекса COPI могут участвовать в доставке кальция из вакуоли в эндоплазматический ретикулум, минуя аппарат Гольджи.

В ходе изучения природных отличий дрожжей O. polymorpha и O. parapolymorpha по устойчивости к токсичному аналогу фосфата ванадату было обнаружено, что присоединение маннозилфосфата к гликозидным цепям белков оказывает существенное влияние на регуляцию промотора высокоаффинного переносчика фосфата плазмалеммы Pho84.

Сотрудники

СОСТАВ ЛАБОРАТОРИИ

ФИО Ученая степень, звание Должность Место работы Городской телефон Внутренний телефон E-mail
1Агафонов
Михаил Олегович
к.б.н.в.н.с., руководитель группыИНБИ, корп. 2, комн. 304(495) 954-40-97454agaphonov@inbi.ras.ru
2Каргинов
Азамат Валерьевич
-м.н.с.ИНБИ, корп. 2, комн. 304(495) 954-40-97454karginovaz@mail.ru

Публикации

ЗНАЧИМЫЕ ПУБЛИКАЦИИ
  1. Karginov AV, Fokina AV, Kang HA, Kalebina TS, Sabirzyanova TA, Ter-Avanesyan MD, Agaphonov MO. Dissection of differential vanadate sensitivity in two Ogataea species links protein glycosylation and phosphate transport regulation. Sci Rep. 2018, 8:16428. doi: 10.1038/s41598-018-34888-5.
  2. Agaphonov MO. Improvement of a yeast self-excising integrative vector by prevention of expression leakage of the intronated Cre recombinase gene during plasmid maintenance in Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett. 2017 364(22).doi: 10.1093/femsle/fnx222.
  3. Karginov A, Agaphonov M. A simple enrichment procedure improves detection of membrane proteins by immunoblotting. Biotechniques. 2016, 61:260-261.
  4. Fokina AV, Chechenova MB, Karginov AV, Ter-Avanesyan MD, Agaphonov MO. Genetic Evidence for the Role of the Vacuole in Supplying Secretory Organelles with Ca2+ in Hansenula polymorpha. PLoS One. 2015, 10:e0145915. doi:10.1371/journal.pone.0145915.
  5. Moon HY, Cheon SA, Kim H, Agaphonov MO, Kwon O, Oh DB, Kim JY, Kang HA. Hansenula polymorpha Hac1p Is Critical to Protein N-Glycosylation Activity Modulation, as Revealed by Functional and Transcriptomic Analyses. Appl Environ Microbiol. 2015, 81:6982-93. doi: 10.1128/AEM.01440-15.
  6. Kim H, Thak EJ, Lee DJ, Agaphonov MO, Kang HA. Hansenula polymorpha Pmt4p Plays Critical Roles in O-Mannosylation of Surface Membrane Proteins and Participates in Heteromeric Complex Formation. PLoS One. 2015, 10:e0129914. doi: 10.1371/journal.pone.0129914.
  7. Agaphonov M, Alexandrov A. Self-excising integrative yeast plasmid vectors containing an intronated recombinase gene. FEMS Yeast Res. 2014, 14:1048-1054. doi: 10.1111/1567-1364.12197.
  8. Kim H, Moon HY, Lee DJ, Cheon SA, Yoo SJ, Park JN, Agaphonov MO, Oh DB, Kwon O, Kang HA. Functional and molecular characterization of novel Hansenula polymorpha genes, HpPMT5 and HpPMT6, encoding protein O-mannosyltransferases. Fungal Genet Biol. 2013, 58-59:10-24. doi: 10.1016/j.fgb.2013.08.003.
  9. Fokina AV, Sokolov SS, Kang HA, Kalebina TS, Ter-Avanesyan MD, Agaphonov MO. Inactivation of Pmc1 vacuolar Ca2+ ATPase causes G2 cell cycle delay in Hansenula polymorpha. Cell Cycle. 2012, 11:778-784. doi:10.4161/cc.11.4.19220.
  10. Agaphonov M, Romanova N, Choi ES, Ter-Avanesyan M. A novel kanamycin/G418 resistance marker for direct selection of transformants in Escherichia coli and different yeast species. Yeast. 2010, 27:189-195. doi: 10.1002/yea.1741.
  11. Agaphonov MO, Plotnikova TA, Fokina AV, Romanova NV, Packeiser AN, Kang HA, Ter-Avanesyan MD. Inactivation of the Hansenula polymorpha PMR1 gene affects cell viability and functioning of the secretory pathway. FEMS Yeast Res. 2007 7:1145-1152.
  12. Agaphonov MO, Sokolov SS, Romanova NV, Sohn JH, Kim SY, Kalebina TS, Choi ES, Ter-Avanesyan MD. Mutation of the protein-O-mannosyltransferase enhances secretion of the human urokinase-type plasminogen activator in Hansenula polymorpha. Yeast. 2005, 22:1037-1047.
  13. Agaphonov M, Romanova N, Sokolov S, Iline A, Kalebina T, Gellissen G, Ter-Avanesyan M. Defect of vacuolar protein sorting stimulates proteolytic processing of human urokinase-type plasminogen activator in the yeast Hansenula polymorpha. FEMS Yeast Res. 2005, 5:1029-1035.
  14. Chechenova MB, Romanova NV, Deev AV, Packeiser AN, Smirnov VN, Agaphonov MO, Ter-Avanesyan MD. C-terminal truncation of alpha-COP affects functioning of secretory organelles and calcium homeostasis in Hansenula polymorpha. Eukaryot Cell. 2004, 3:52-60.
  15. Agaphonov MO, Romanova NV, Trushkina PM, Smirnov VN, Ter-Avanesyan MD. Aggregation and retention of human urokinase type plasminogen activator in the yeast endoplasmic reticulum. BMC Mol Biol. 2002, 3:15.
  16. Kang, H.A., Sohn, J.H., Agaphonov, M.O., Choi, E.S., M.D., T.-A., and Rhee, S.K. 2002. Development of expression systems for the production of recombinant proteins in Hansenula polymorpha DL-1, pp. 124–146. In Gellissen, G. (ed.), Hansenula polymorpha-Biology and Applications. Wiley-VCH, Weinheim, Germany.
  17. Kim MW, Agaphonov MO, Kim JY, Rhee SK, Kang HA. Sequencing and functional analysis of the Hansenula polymorpha genomic fragment containing the YPT1 and PMI40 genes. Yeast. 2002, 19:863-871.
  18. Agaphonov MO, Packeiser AN, Chechenova MB, Choi ES, Ter-Avanesyan MD. Mutation of the homologue of GDP-mannose pyrophosphorylase alters cell wall structure, protein glycosylation and secretion in Hansenula polymorpha. Yeast. 2001, 18:391-402.
  19. Agaphonov MO, Trushkina PM, Sohn JH, Choi ES, Rhee SK, Ter-Avanesyan MD. Vectors for rapid selection of integrants with different plasmid copy numbers in the yeast Hansenula polymorpha DL1. Yeast. 1999, 15:541-551.
  20. Bogdanova AI, Kustikova OS, Agaphonov MO, Ter-Avanesyan MD. Sequences of Saccharomyces cerevisiae 2 microns DNA improving plasmid partitioning in Hansenula polymorpha. Yeast. 1998, 14:1-9.
  21. Sohn JH, Choi ES, Kim CH, Agaphonov MO, Ter-Avanesyan MD, Rhee JS, Rhee SK. A novel autonomously replicating sequence (ARS) for multiple integration in the yeast Hansenula polymorpha DL-1. J Bacteriol. 1996, 178:4420-4428.
  22. Agaphonov MO, Beburov MYu, Ter-Avanesyan MD, Smirnov VN. A disruption-replacement approach for the targeted integration of foreign genes in Hansenula polymorpha. Yeast. 1995, 11:1241-1247.
  23. Bogdanova AI, Agaphonov MO, Ter-Avanesyan MD. Plasmid reorganization during integrative transformation in Hansenula polymorpha. Yeast. 1995, 11:343-353.
  24. Agaphonov MO, Poznyakovski AI, Bogdanova AI, Ter-Avanesyan MD. Isolation and characterization of the LEU2 gene of Hansenula polymorpha. Yeast. 1994, 10:509-513.