Микробы тоже знают, что такое стресс, только вместо дедлайнов и уведомлений им достаются кислота, голод, гипоксия и атака иммунной системы. В лаборатории биохимии стрессов микроорганизмов ФИЦ Биотехнологии РАН разбираются, как бактерии выживают в таких условиях, уходят в «спячку» и годами пережидают антибиотики и защиту организма. Руководитель лаборатории Маргарита Шлеева в интервью объединенной редакции проектов «Индикатор» и InScience.News рассказывает, чем стресс у микробов отличается от человеческого, почему «заснувшие» бактерии так мешают лечить туберкулез и можно ли сначала разбудить патоген, а потом уже окончательно с ним расправиться.
— Вы возглавляете лабораторию биохимии стрессов микроорганизмов. Почему лаборатория так называется? Когда появилось это название?
— Лаборатория биохимии стрессов микроорганизмов называется так потому, что её основное направление с самого начала было сосредоточено на изучении молекулярных механизмов адаптации микроорганизмов к неблагоприятным условиям среды — то есть к стрессовым факторам. Название окончательно закрепилось в конце 1990-х, когда лаборатория под руководством профессора Арсения Сумбатовича Капрельянца сфокусировалась на биохимических процессах, происходящих в микробных клетках при действии таких факторов, как закисление, гипоксия, окислительный стресс, недостаток питательных веществ, экстремальные температуры, осмотический шок, токсичные вещества.
— Что такое «стресс» для микробов и чем он принципиально отличается от стресса у человека? Понятно, что стресс подразумевается не психологический, а какие-то сложные условия или воздействие на клеточном уровне, и у клеток человека он тоже есть. Есть ли какие-то отличия в стрессовых факторах для клеток человека и микроорганизмов или в их реакции на такие факторы?
— «Стресс» у микроорганизмов — это не психологическое понятие, а физиолого-биохимическое состояние, возникающее, когда внешние условия нарушают гомеостаз и нормальное функционирование клетки, что заставляет микроба активировать специальные адаптационные программы: менять экспрессию генов, синтезировать защитные белки (например, шапероны), модифицировать клеточную стенку и перестраивать метаболизм, а в критических случаях переходить в состояние покоя (некультивируемые формы, анабиоз).
У клеток человека тоже есть клеточный стресс (окислительный стресс, повреждение ДНК, тепловой шок), и многие стрессовые факторы на молекулярном уровне могут быть схожими — например, активные формы кислорода или токсичные соединения повреждают и бактерию, и клетку человека. Однако есть и принципиальные отличия.
Во-первых, набор ключевых стрессоров: для микроорганизмов критически важны такие параметры среды, как pH, осмотическое давление, гипоксия, доступность железа или источников углерода, которые в норме у человека в тканях строго регулируются, и микробу приходится адаптироваться к их резким изменениям, тогда как клетки человека живут в относительно стабильном микроокружении.
Во-вторых, у микроорганизмов нет системной регуляции стресса через нервную или эндокринную систему – у них нет кортизола, адреналина или воспалительных цитокинов в том смысле, в каком они есть у многоклеточного организма.
В-третьих, главное эволюционное отличие – способ ответа на запредельный стресс: многие бактерии способны уходить в обратимую покоящуюся форму (некультивируемое состояние) без образования спор, что позволяет им выживать годами и десятилетиями, а затем реактивироваться при появлении благоприятных условий; клетки человека в многоклеточном организме такой возможности массово не имеют при необратимом повреждении они уходят в апоптоз или некроз.
И наконец, у человека стресс часто рассматривается как системный ответ всего организма с участием гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси, тогда как для микроорганизмов стресс – это сугубо клеточная и молекулярная проблема выживания «одиночки» или популяции. Таким образом, название лаборатории точно отражает её предмет: биохимию тех удивительных механизмов, с помощью которых микробы, в отличие от клеток хозяина, учатся жить там, где жить невозможно.
— В каких ситуациях стресс микроорганизмов влияет на жизнь обычного человека?
— Стресс микроорганизмов влияет на жизнь обычного человека постоянно и чаще всего незаметно, причём это влияние может быть как вредным, так и полезным. Например, когда человек испытывает хронический психологический стресс, в его организме растёт уровень кортизола, который повышает проницаемость кишечного эпителия и изменяет микробиом – условно-патогенные бактерии получают сигнал к активации, начинают активнее размножаться и подавлять полезные микроорганизмы, вызывая дисбактериоз, воспаление, а иногда и системное воспаление через проникновение бактериальных липополисахаридов в кровь. Более того, такой стресс-индуцированный дисбактериоз способен влиять на психическое здоровье: сдвиги в составе микробиоты меняют метаболизм триптофана, снижая доступность предшественника серотонина и способствуя развитию тревожных состояний и депрессии.
С другой стороны, человек сознательно использует стресс микроорганизмов в своих интересах – например, при приёме антибиотиков или дезинфектантов, которые вызывают у бактерий окислительный или осмотический стресс, приводящий к их гибели. Особого внимания заслуживает ситуация, когда стресс для микробов создаёт сама иммунная система человека: фагоциты (нейтрофилы и макрофаги) атакуют вторгшиеся бактерии «кислотными ловушками» (снижение pH в фаголизосомах), активными формами кислорода и азота (оксидативный и нитрозативный стресс), антимикробными пептидами и дефицитом железа. Этот мощный многокомпонентный стресс либо убивает патогена, либо, если бактерия устойчива, переводит её в покоящееся состояние. Классический пример – микобактерия туберкулёза: внутри макрофага она испытывает голод, гипоксию, закисление и атаку реактивных интермедиатов, но выживает, уходя в латентную форму, а затем при ослаблении иммунитета (стресс хозяина) реактивируется. Таким образом, даже не задумываясь об этом, каждый день мы сталкиваемся с ситуациями, где стресс микробов либо защищает нас (санитарная обработка, работа иммунитета, консервация продуктов), либо, напротив, оборачивается проблемой (реактивация латентных инфекций на фоне усталости или болезни хозяина).
 |
 |
— Какие способы позволяют вызвать у микроорганизмов стресс специально, чтобы победить инфекцию, но не навредить при этом клеткам человека?
— Современная медицина располагает несколькими стратегиями, позволяющими избирательно вызывать стресс у патогенных микроорганизмов, практически не затрагивая клетки хозяина. Классический подход – антибиотики, которые нацелены на уникальные бактериальные структуры: синтез клеточной стенки (пенициллины), бактериальные рибосомы (тетрациклины, макролиды) или бактериальные ферменты репликации ДНК (фторхинолоны), – что для эукариотических клеток человека малотоксично.
Другой мощный и высокоселективный метод – фотодинамическая терапия: пациенту вводят фотосенсибилизатор, который преимущественно накапливается в бактериальных клетках, а затем облучают поражённый участок светом строго определённой длины волны, что генерирует внутри микробной клетки взрыв активных форм кислорода и вызывает необратимый окислительный стресс; при этом здоровые ткани человека, если они не содержат фотосенсибилизатор, не страдают.
Третий подход – бактериофаготерапия, где вирусы, специфичные только к бактериям, вызывают лизис и стресс у целевых патогенов, не взаимодействуя с клетками человека.
Наконец, активно развиваются комбинированные методы, например, специфические ферменты сначала разрушают защитную биоплёнку, а затем антибиотики и фаги добивают вышедшие из нее бактерии – причём каждый из этих агентов действует через разные механизмы стресса, что снижает вероятность развития устойчивости.
— Бывают ли обратные ситуации, когда микроорганизм сидит в организме человека и не причиняет неудобств, но при каком-то стрессе делает хозяину «подлянки»?
— Да, такие обратные ситуации – классика латентных и условно-патогенных инфекций, и в практике врача они встречаются сплошь и рядом. Яркий пример – микобактерии туберкулёза: по оценкам ВОЗ, около четверти населения Земли инфицировано латентным туберкулёзом, при котором бактерии годами покоятся внутри организма хозяина, не вызывая симптомов; но если человек переживает тяжёлый стресс (голодание, сопутствующее заболевание, ВИЧ-инфекцию, химиотерапию или просто хроническое истощение), иммунный контроль ослабевает, и спящие микобактерии выходят из покоя, вызывая активный деструктивный туберкулёз. Даже обычная условно-патогенная флора кишечника, например некоторые штаммы Escherichia coli или Enterococcus faecalis, при хроническом стрессе хозяина может начать избыточно размножаться и прорывать ослабленный кишечный барьер, вызывая воспаление, бактериемию или сепсис у ослабленных пациентов. Таким образом, «подлянка» от микроорганизма происходит именно в момент стресса хозяина: то, что бактерия или вирус десятилетиями терпеливо ждали, становится для них сигналом к действию.
— Бактерии умеют «засыпать» и годами пережидать лечение и атаку иммунитета. Можно ли сравнить это с режимом экономии энергии у животных или растений, и почему нам, людям, это так усложняет терапию?
— Да, состояние бактериальной «спячки» (анабиоза, покоящихся форм или персистенции) вполне можно сравнить с режимом экономии энергии у животных и растений – это эволюционно древняя стратегия выживания при резком ухудшении условий: недостатке питания, закислении, гипоксии, высыхании или экстремальных температурах. У животных аналогом служат спячка (медведи, грызуны), оцепенение (насекомые) или диапауза (эмбрионы), при которых метаболизм замедляется до минимума, а у растений — покоящиеся семена и споры, сохраняющие жизнеспособность годами. Именно замедление метаболизма бактерий (гипобиоз) и создаёт главную проблему для терапии: антибиотики почти всегда нацелены на активно растущие и делящиеся бактерии (синтез клеточной стенки, белка, ДНК), а в «спящих» персистерах все эти процессы заморожены, поэтому препараты просто не работают. Более того, такие бактерии не только не погибают от антибиотиков, но и становятся «невидимыми» для иммунной системы, так как не производят типичных антигенов и не вызывают воспаления. В итоге после курса лечения популяция пробуждается спонтанно (от нескольких дней до многих лет спустя) и даёт рецидив инфекции, что мы наблюдаем при туберкулёзе, хронических инфекциях мочевыводящих путей, муковисцидозе и имплант-ассоциированных инфекциях.
— Что заставляет бактерии впадать в такой анабиоз?
— Бактерии переходят в состояние анабиоза под действием жёстких стрессовых сигналов, которые делают нормальный рост и деление невозможным или смертельно опасными. Основные триггеры: это голодание (дефицит углерода, азота, фосфора, железа), экстремальные значения pH (например, закисление внутри фаголизосом макрофагов), окислительный и нитрозативный стресс (атака активными формами кислорода и азота со стороны иммунных клеток), высокая температура, осмотический шок, а также прямое воздействие антибиотиков и дезинфектантов, которые индуцируют специализированные стресс-ответы. Внутри бактериальной клетки эти сигналы запускают сложные регуляторные каскады, например, активацию токсин-антитоксиновых систем, синтез сигнальных молекул (гуанозинтетрафосфат, (p)ppGpp), изменение экспрессии сотен генов и, в конечном счёте, остановку репликации, транскрипции и трансляции. У некоторых видов это сопровождается морфологическими изменениями: уплотнением нуклеоида, модификацией клеточной стенки, образованием многослойных защитных структур (цист) или, у немногих бактерий, настоящих спор. Важно понимать, что анабиоз – это не единое состояние, а континуум: от частичного замедления метаболизма до «глубокого сна», где практически нет детектируемой биохимической активности, но клетка остаётся жизнеспособной. У неспорообразующих бактерий (например, микобактерии, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa) даже в самом глубоком анабиозе сохраняется остаточный, или минимальный, метаболизм. Он включает: поддержание мембранного потенциала (за счёт очень медленного протонного насоса); базовый уровень репарации ДНК; оборот некоторых РНК и белков токсин-антитоксиновых систем; крайне низкое, но измеримое потребление кислорода или глюкозы. Этот минимальный метаболизм необходим для поддержания целостности клетки и быстрого выхода из анабиоза при улучшении условий. Полной остановки всей биохимии у неспорообразующих форм не происходит, иначе клетка не смогла бы «проснуться» без синтеза всех компонентов с нуля.
Совсем иная ситуация у немногих бактерий, способных к споруляции (например, Bacillus или Clostridium). Споры – это не просто «глубокий анабиоз», а принципиально иная структурная и метаболическая фаза. Происходит полная остановка метаболизма. В зрелой споре нет детектируемого потребления кислорода, синтеза АТФ, транскрипции или трансляции. Считается, что спора находится в состоянии «криптобиоза» с практически нулевой биохимической активностью. Выражены защитные структуры: многослойная оболочка, кортекс, дипиколиновая кислота в ядре, кальций, сателлиты ДНК — малые кислоторастворимые белки, которые физически защищают ДНК от тепла, УФ и окислителей. Происходит дегидратация ядра, до 25–30% воды (против 80% у вегетативной клетки), что резко повышает термостойкость.
Главное отличие: если неспорообразующая бактерия в глубоком анабиозе всё ещё требует минимального метаболизма и через недели–годы погибает от накопления повреждений, то спора может сохранять жизнеспособность столетиями и даже тысячелетиями без какого-либо метаболизма. Пробуждение споры требует сложного триггера (например, аминокислоты или глюкозы) и запуска процесса прорастания, включающего гидролиз кортекса, регидратацию и рефолдинг белков.
— Можно ли «пробудить» спящие бактерии, чтобы улучшить ход лечения?
— Да, идея «разбудить и убить» – одно из перспективных направлений современной антимикробной терапии, и экспериментальные подтверждения уже получены. Если заставить покоящиеся бактерии временно выйти из анабиоза, они возобновят рост и деление, а значит, станут чувствительными к обычным антибиотикам, которые на них раньше не действовали. Учёные пробуют разные подходы: добавление питательных веществ (цинка, железа, аминокислот, факторов роста) может реактивировать часть персистеров; обнаружено, что белки Rpf (resuscitation promoting factors), которые наша лаборатория изучает более 20 лет (о них подробнее пойдет речь во второй части интервью – примечание редакции), способны пробуждать покоящиеся микобактерии, действуя как пептидогликангидролазы и высвобождая сигнальные муропептиды. Другой пример – недавнее открытие механизма пробуждения E. coli через деградацию пор, образованных пептидом HokB, что восстанавливает мембранный потенциал и энергетику клетки. В лабораторных условиях комбинация «будильника» (Rpf, питательных веществ, специфических метаболитов) с классическими антибиотиками действительно позволяет уничтожить популяции, которые ранее были абсолютно устойчивы. Однако есть и ограничения: во-первых, некоторые бактерии уходят в настолько глубокий анабиоз, что их невозможно пробудить никакими известными стимулами; во-вторых, массовое пробуждение всех спящих клеток в организме может вызвать резкую вспышку воспаления и бактериемию; в-третьих, требуется высокая селективность, чтобы не затрагивать нормальную микробиоту. Тем не менее, стратегия остаётся одной из надежд на победу над хроническими и латентными инфекциями, и в нашей лаборатории мы активно работаем над комбинациями Rpf-подобных сигналов с фотодинамической терапией, микобактериофагами и антибиотиками.
— Вы изучаете эти механизмы на молекулярном уровне. Как ваши результаты в перспективе могут повлиять на появление новых лекарств или методов профилактики – что в этом увидит пациент, а не только специалист?
— Изучение молекулярных механизмов анабиоза и персистенции бактерий напрямую ведёт к появлению таких лекарств и методов, которые пациент ощутит, как кардинальное изменение самого процесса лечения. Вместо долгих месяцев или лет приёма антибиотиков, которые при туберкулёзе или хронических инфекциях мочевыводящих путей часто не дают гарантии излечения, появятся короткие курсы комбинированной терапии. Как это будет работать? На основе наших знаний о белках Rpf (факторах реактивации) или о токсин-антитоксиновых системах фармацевты смогут создать препараты-«будильники» – молекулы, которые заставляют «спящие» бактерии временно проснуться, начать расти и делиться, а значит, стать уязвимыми для обычных антибиотиков. Пациент увидит, что после такого «разбуди и убей» инфекция не возвращается через полгода или год, потому что в организме не остаётся персистеров – тех самых клеток, которые раньше тихо пережидали терапию. Одновременно появятся ингибиторы механизмов анабиоза: препараты, блокирующие переход бактерий в спячку, например, нарушающие сигнальные каскады с (p)ppGpp или препятствующие синтезу метилированных порфиринов – тогда патоген просто не сможет «заснуть», и стандартный антибиотик убьёт его с первого раза. Для пациента это означает не только более быстрое выздоровление, но и радикальное снижение рецидивов, а также возможность избежать тяжёлых побочных эффектов от многомесячных курсов терапии.
Особая стратегия – разработка методов инактивации бактерий на основе пролекарств с неспецифическим действием и концепция «Троянского коня». Пациент, возможно, даже не узнает о сложности этой технологии, но ощутит её результат: антибиотик, который раньше не действовал на спящие клетки, вдруг начинает работать. Как это устроено на молекулярном уровне? Создаются пролекарства – неактивные соединения, которые бактерия сама, даже находясь в анабиозе, вынуждена метаболизировать (например, через остаточные ферменты синтеза клеточной стенки или энергетического обмена). Внутри клетки пролекарство превращается в активный токсин. Ещё более изящна концепция «Троянского коня»: к «лошади» – транспортной молекуле, которую бактерия активно забирает из среды даже в спячке (например, сидерофоры для захвата железа), — прикреплён «вооружённый отряд» – токсин или фотосенсибилизатор. Бактерия сама «затаскивает» внутрь своего убежища убийцу. Для пациента это означает, что лекарство начинает действовать без необходимости пробуждать бактерию – и, следовательно, без риска, что проснувшийся патоген успеет размножиться или запустить механизмы резистентности. Такой подход особенно важен при биоплёночных инфекциях (например, на искусственных суставах или катетерах), где обычные антибиотики бесполезны, и пациенту часто требуется хирургическое удаление имплантата.
Что касается профилактики, то здесь результаты лабораторных исследований трансформируются в диагностические тесты, о существовании которых обычный человек сегодня даже не догадывается. Например, пациент с латентным туберкулёзом или рецидивирующим циститом сможет сдать анализ не просто на наличие бактерии, а на маркеры её состояния – уровень экспрессии определенных генов, накопление порфиринов или специфические метаболиты, сигнализирующие, что бактерия уже перешла в покоящуюся форму. Врач получит чёткий ответ: «инфекция активна» или «микроб затаился, лечить нужно иначе». Более того, для людей из групп риска (пациентов с муковисцидозом, с имплантированными катетерами или искусственными суставами, с иммунодефицитами) появятся персонализированные протоколы профилактики: не просто «пейте антибиотики», а схемы с использованием модуляторов микробиоты, пробиотиков, а в перспективе даже вакцин нового поколения, нацеленных на белки персистенции. Пациент увидит, что хроническая инфекция перестаёт быть неизбежностью, а профилактика становится предсказуемой и научно обоснованной.
И наконец, самый прямой и наглядный для пациента пример – это развитие антимикробной фотодинамической терапии, о которой мы говорили ранее. Сегодня человек с туберкулёзом, особенно с лекарственно-устойчивой формой, вынужден годами принимать тяжёлые препараты с токсичными побочными эффектами. На основе нашего открытия о накоплении порфиринов в покоящихся микобактериях разрабатывается метод, при котором пациенту вводят безвредный фотосенсибилизатор, а затем облучают область инфекции светом – спящие бактерии, содержащие эндогенные порфирины или вегетативные микобактерии, избирательно захватившие экзогенный сенсибилизатор, сами генерируют активные формы кислорода и погибают, а здоровые клетки человека не страдают. В итоге пациент получает короткую, нетоксичную процедуру вместо многомесячной химиотерапии. Именно так фундаментальная наука превращается в конкретное улучшение качества жизни: меньше боли, меньше страха перед рецидивом, меньше времени, потерянного на лечение, и больше шансов вернуться к нормальной жизни.
— Если представить, что у вас есть минута, чтобы убедить старшеклассника пойти в биохимия, чтобы вы ему сказали: чем эта область по настоящему увлекательна и важна для будущего медицины и биотехнологий?
— Представь, что все живое от бактерии до человека работает по единым молекулярным правилам, и биохимия дает тебе ключи к пониманию и переписыванию этих правил. Ты узнаешь, как белки, гены и метаболиты управляют здоровьем и болезнью, и сможешь создавать лекарства, которые бьют точно в цель: блокируют вредные молекулы, заставляют раковые клетки самоуничтожаться или пробуждают спящие бактерии, чтобы антибиотики наконец сработали. Но самое захватывающее – биохимия стала конструктором: мы уже перепрограммируем бактерии производить инсулин, гормоны роста и даже экологичный пластик, а с помощью CRISPR редактируем гены, как текст в документе. Сейчас на стыке биохимии, ИИ и инженерии происходит революция: секвенирование ДНК, которое раньше стоило миллиарды, теперь делают за пару часов за тысячу рублей; создают искусственные органы на биопринтерах; разрабатывают персонализированную медицину, где лечение подбирают под твой уникальный обмен веществ. И это не фантастика, это то, чем прямо сейчас занимаются биохимики. Ты сможешь участвовать в создании вакцин против новых вирусов, бороться со старением на молекулярном уровне, разрабатывать биосенсоры для ранней диагностики рака или даже искать следы жизни на Марсе, потому что биохимия универсальна. Биотехнологии сегодня – это новые IT: стартапы в области генной терапии, синтетической биологии и микробиома растут как грибы, и им остро нужны молодые таланты, которые не боятся думать и экспериментировать. Если ты хочешь не просто пользоваться технологиями будущего, а создавать их своими руками; если тебе интересно, как на самом деле работает жизнь на молекулярном уровне, и ты готов решать реальные задачи вроде победы над антибиотикорезистентностью или создания экологичного биотоплива, то биохимия даст тебе эти суперспособности.
Биохимик может работать где угодно – в научной лаборатории, в фармкомпании, в биотех-стартапе, в больнице, в пищевой промышленности или даже в криминалистике. Это профессия с бесконечным выбором направлений. И самое главное: в биохимии ещё полно белых пятен. То, что ты откроешь сегодня, через 10 лет может стать стандартом лечения или новой отраслью. Ты можешь быть первым. Приходи, будет сложно, но именно так меняют мир!