ОСНОВНЫЕ ДОСТИЖЕНИЯ

Лаборатория занимается изучением физико-химических свойств цветных флуоресцирующих белков и созданием на их основе молекулярных сенсоров для изучения ферментативных реакций in vivo. Наибольшее внимание уделяется двум ферментативным каскадам – каспазному и металлопротеиназному, играющими важную регуляторную роль как в норме, так и в патологии, в частности при программируемой клеточной гибели и в процессах метастазирования и ангиогенезе.

Важным направлением в работе лаборатории является разработка новых маркеров для применения в методах современной субдифракционной микроскопии.

Не менее важным направлением является трансляция уже разработанных сенсоров для клеточной биологии на более сложные системы, в первую очередь на мелких лабораторных животных, экспериментальные модели на которых в настоящее время являются основой при разработке новых лекарств и оценки их системного действия.

С использованием принципиально новых экспериментальной базы и методических подходов в лаборатории ведутся работы по совершенствованию методов фотодинамической терапии опухолей, поиск новых сенсибилизаторов стимулирующих иммунный ответ при фотодинамическом воздействии.

Основные достижения лаборатории:

• Разработаны новые классы меток (фосфоресцентные и лантанидные) для иммуноанализа и других методов анализа по связыванию.
• Разработаны методы селективной фотодеструкции (стерилизации) грамположительных, грамотрицательных бактерий и дрожжей при использовании различных порфиринов.
• Изучена структура монослоев антител (пленки Лэнгмюра-Блоджет) в зависимости от плотности упаковки антител и поверхностного давления (распознающий элемент иммуносенсоров).
• Изучена роль микросекундной конформационной подвижности белковой глобулы в дискриминации субстратов пероксидаз по размеру.
• Совместно с Институтом биоорганической химии им. Академиков Шемякина и Овчинникова открыт новый класс флуоресцирующих цветных белков и хромопротеинов из кораллов, гомологичных GFP.
• Установлена природа фемтосекундной дезактивации возбужденного состояния белка KFP (мутант asFP595), при этом разгорание флуоресценции при изменении мощности светового облучения связано с последовательным поглощением двух фотонов, при этом первый фотон формирует новое конформационное состояние в белке, ответственное за интенсивную флуоресценцию белка.
• Методам молекулярного моделирования КМ/ММ установлена определяющая роль конформации белка asFP595 в формировании энергетически предпочтительного транс состояния хромофора в основном состоянии, по сравнению с другими белками и водными растворами. Расчеты возбужденного состояния хромофора в цис-конформации в белковом окружении подтверждают гипотезу транс-цис изомеризации при возгорании флуоресценции белка asFP595. Методами флуоресцентной спектроскопии подтверждено, что в хромопротеине asFP595 и его мутантах при щелочных значениях рН флуоресцирует цис форма хромофора, которая имеет характеристический максимум поглощения S0-S2 при 340 нм.
• Установлены причины аггрегации цветных белков из коралов и получены неаггрегирующиемутанты для всей группы белков.Открыт новый фотопереключаемый белок SAASOti и получены его мономерные формы. Белок имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционно используемым в субдифракционном методе PALM белком KAEDE.
  — Разработаны методы перевиваемости флуоресцирующих опухолей без потери ими антигенныхсвойств, что позволяет изучать методами молекулярного имиджинга прижизненное действиепротивоопухолевых препаратов.
• Были получены и охарактеризованы генетически кодируемыесубстраты каспазы 3: TR-23-К на основе мономерного белка TagRFP и тетрамера КFP и Tb3+-СП-TagRFP на основе тербийсвязывающего пептида и мономера TagRFP. Показана возможность эффективной трансфекции и экспрессии конструкции TR-23-К вопухолевых клеточных линиях. Лентивируснаятрансфекция выбрана как оптимальный способ трансфекции исходя из скорости получения трансдуктанта и эффективности его выхода. Получены 3 линии клеток человеческих опухолей эпидермальногопроисхождения, трансфецированныхTagRFP/KFP-сенсором. Была осуществлена регистрация протеолитической активности каспазы-3, ключевого ферментаапоптоза, в живых клетках с использованием FRET-FLIM технологии и конфокальной микроскопии. Анализ распределения временижизни в клетках позволил дискриминировать апоптотические клетки от живых клеток в пределаходной клеточной популяции.

В группе изучения активных форм кислорода:

• Обнаружение фосфоресценции триплетного хлорофилла и его аналогов сначала в растворах этих соединений, а затем в листьях растений, хлоропластах, их фрагментах и изолированных реакционных центрах фотосистемы 2. Использование этого эффекта для регистрации и изучения триплетных состояний хлорофилла и его предшественников в фотосинтетическом аппарате и модельных сисемах. Демонстрация того, что измерение фосфоресценции – эффективный метод анализа механизма и глубины фотоокислительного стресса в растениях.
• Обнаружение фосфоресценции ИК синглетного молекулярного кислорода в аэрированных растворах хлорофилла и других пигментов-фотосенсибилизаторов при комнатной температуре. Широкое применение этого явления для выяснения роли синглетного кислорода в связи с проблемами фотохимии, фотобиологии и фотомедицины.
• Создание уникальных лазерных спектрометров для кинетических измерений фосфоресценции синглетного кислорода в воде и суспензиях клеток. Наиболее точное измерение времени жизни синглетного кислорода в воде.
• Приоритет данной группы в обнаружении этих явлений полностью признан. Метод измерения фотосенсибилизированной фосфоресценции синглетного кислорода повсеместно и широко используется в экспериментальных исследованиях.

В лаборатории получены гранты РНФ, по программе Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», РФФИ и др.

Сотрудники лаборатории ежегодно участвуют в различных отечественных и международных мероприятиях в качестве экспертов, докладчиков и слушателей.

В лаборатории постоянно ведется работа с молодежью и проводится работа по подготовке молодых специалистов. За время существования Лаборатории по тематике исследований были защищены 1 докторская и более 10 кандидатских диссертаций.

СОСТАВ ЛАБОРАТОРИИ

УНИКАЛЬНОЕ ОБОРУДОВАНИЕ

1.  A.V.Gavshina, N.K.Marynich, M.G.Khrenova, I.D.Solovyev, A.P.Savitsky.  The Role of Cysteine Residues in the Allosteric Modulation of the Chromophore Phototransformations of Biphotochromic Fluorescent Protein SAASoti. Scientific reports, DOI: 10.1038/s41598-021-03634-9 (2021). Q1
2. M Shleeva, A Savitsky, A Kaprelyants. Photoinactivation of mycobacteria to combat infection diseases: current state and perspectives. Applied Microbiology and Biotechnology, 1-11, (2021) Q1
3. D.K Tuchina, I. G Meerovich, O. A Sindeeva, V.V Zherdeva, A. P Savitsky, A.A Bogdanov Jr, V. V Tuchin. Magnetic resonance contrast agents in optical clearing: Prospects for multimodal tissue imaging. Journal of Biophotonics, e201960249 (2020) Q1
4. Shleeva MO, Savitsky AP, Nikitushkin VD, Solovyev ID, Kazachkina NI, Perevarov V.V., Kaprelyants A.S. Photoinactivation of dormant Mycobacterium smegmatis due to its endogenous porphyrins. Applied microbiology and biotechnology, 1-9 (2019)
5. Solovyev ID, Gavshina AV, Savitsky AP. Novel Phototransformable Fluorescent Protein SAASoti with Unique Photochemical Properties. International journal of molecular sciences 20 (14), 3399 (2019)
6. Solovyev, I.D., Gavshina, A.V., Katti, A.S., Chizhik, A.I., Vinokurov, L.M., Lapshin, G.D., Ivashina, T.V., Khrenova, M.G., Kireev, I.I., Gregor, I., Enderlein, J., and Savitsky, A.P. Monomerization of the photoconvertible fluorescent protein SAASoti by rational mutagenesis of single amino acids, Scientific reports, 8 (1), 15542 (2018)
7. V.V. Zherdeva; N.I. Kazachkina; V.I. Shcheslavskiy; A.P. Savitsky. Long-term fluorescence lifetime imaging of a genetically encoded sensor for caspase-3 activity in mouse tumor xenografts. J. of Biomedical Optics, 23(3), 035002 (2018)
8. Matz M.V., Fradkov A.F., Labas Y.A., Savitsky A.P., Zaraisky A.G., Markelov M.L., Lukyanov S.A. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. — Nat Biotechnol, 1999, Oct 17(10), p. 969-73
9. Lukyanov K.A., Fradkov A.F., Gurskaya N.G., Matz M.V., Labas Yu.A., Savitsky A.P., Markelov M.L., Zaraisky A.G., Zhao X., Fang Y., Tan W., Lukyanov S.A. Natural Animal coloration can be determined by a nonfluorescent green fluorescent protein homolog. — J.Biol.Chem., 2000, v. 275, N. 34, p. 25879-25882
10. Alexander P. Savitsky, Alexander L. Rusanov, Victoria V. Zherdeva, Tatiana V. Gorodnicheva, Maria G. Khrenova and Alexander V. Nemukhin. FLIM-FRET Imaging of Caspase-3 Activity in Live Cells Using Pair of Red Fluorescent Proteins. -Theranostics, 2012, v. 2, N 2, pp. 215-226. (DOI:10.7150/thno.3885)
11. B. Grigorenko, A. Savitsky, I. Topol, S. Burt, A.Nemukhin. Ground-State Structures and Vertical Excitations for the Kindling Fluorescent Protein asFP595. — J. Phys. Chem. B, 2006, v.110, p.18635-18640
12. I.V. Turchin, V.A. Kamensky, V.I. Plehanov, A.G. Orlova, M.S. Kleshnin, I.I. Fiks, M.V. Shirmanova, I.G. Meerovich, L.R. Arslanbaeva, V.V. Jerdeva, A.P. Savitsky. Fluorescence diffuse tomography for detection of red fluorescent protein expressed tumors in small animals. — Journal of Biomedical Optics, 2008, v.13, N 4
13. Tanja A. Schüttrigkeit, Till von Feilitzsch, Christian K. Kompa, Konstantin A. Lukyanov, Alexander P. Savitsky, Alexander A. Voityuk and Maria E. Michel-Beyerle. Femtosecond study of light-induced fluorescence increase of the dark chromoprotein asFP595. — Chemical Physics, 2006, v. 323, p. 149-160
14. Romanova N.A., Brovko L.Y., Moore L., Pometun E., Savitsky A.P., Ugarova N.N., Griffiths M.W. Assessment of Photodynamic Destruction of Escherichia coli O157:H7 and Listeria monocytogenes by Using ATP Bioluminescence. — Applied and Environmental Microbiology, 2003, v. 69, p. 6393–6398
15. Krasnovsky A. A. Luminescence and photochemical studies of singlet oxygen photonics. — J. Photochem. Photobiol.: A: Chem., 2008, v. 196, p. 210-218
16. Krasnovsky A. A. Сhlorophyll isolation, structure and function: major landmarks of the early history of research in the Russian Empire and the Soviet Union. — Photosyth. Res., 2003, v. 76, p. 389-403
17. Krasnovsky A.A., Roumbal Ya.V., Ivanov A.V., Ambartzumian R.V. Solvent depen¬den¬ce of the steady-state rate of 1O2 generation upon excitation of dissolved oxygen by cw 1267 nm laser radiation in air-saturated solutions. Estimates of the absorbance and molar absorption coefficients of oxygen at the excitation wavelength. — Chem. Phys. Lett., 2006, v. 430, p. 260-264

1. Тестирование противоопухолевых лекарственных средств нового поколения на клеточных и животных моделях
2. Тестирование новых нанокомпозитных материалов на биосовместимость in vitro и in vivo
3. Тестирование специфической активности и фотодинамической активности новых красителей и фотосенсибилизаторов
4. Изучение распределения различных флуорофоров и люминесцирующих соединений в организме мышей in vivo