Ключевые слова
Aspergillus niger, Trichoderma reesei, рекомбинантные ферменты, пищевые ферменты, CRISPR/Cas9 геномное редактирование, ненаправленный мутагенез, высокопроизводительный скрининг

Направления исследований

Лаборатория занимается созданием микробных экспрессионных платформ для продукции рекомбинантных ферментов пищевого и технического назначения. Работы ведутся по двум взаимосвязанным направлениям.

• Направление 1. Разработка мутантных штаммов микроорганизмов с улучшенной продуктивностью

Центральная задача — конструирование платформенных штаммов Aspergillus niger и Trichoderma reesei с оптимизированным секреторным фоном для получения секретируемых рекомбинантных белков. «Экспрессионная система» представляет собой универсальное «шасси», пригодное для экспрессии различных целевых генов без повторной оптимизации штамма-хозяина.

Оптимизация секреторного фона включает последовательное удаление генов внеклеточных протеаз и доминантных компонентов секретома, что снижает протеолитическую деградацию целевого белка и высвобождает ресурсы секреторного аппарата клетки. В освобождённые геномные локусы встраиваются синтетические интеграционные площадки для адресной вставки экспрессионных кассет, обеспечивая возможность мультикопийной интеграции целевых генов в заранее охарактеризованные участки генома.

Для реализации этого подхода в лаборатории разработан собственный инструментарий геномного редактирования на основе системы CRISPR/Cas9, функционирующий на обоих модельных организмах. Параллельно ведутся работы по инженерии морфологии нитчатых грибов — управлению формой роста в погружённой культуре для улучшения массообмена и повышения выхода секретируемых белков.

• Направление 2. Создание промышленных штаммов-продуцентов рекомбинантных ферментов и технологий их получения

На основе платформенных штаммов, полученных в рамках первого направления, разрабатываются продуценты конкретных целевых ферментов, которые подбираются с учётом потребностей отечественного рынка и возможностей импортозамещения. Работы включают конструирование экспрессионных кассет, оптимизацию условий культивирования, разработку методов выделения и очистки ферментных препаратов. В перспективе направление предусматривает масштабирование процессов ферментации от лабораторного до пилотного уровня, депонирование штаммов в государственные коллекции микроорганизмов и подготовку документации для регистрации ферментных препаратов.

Основные методы исследований

• Инструменты геномного редактирования
  Создана унифицированная CRISPR/Cas9-система для внесения нокаутов. Система функционирует на двух организмах A. niger и T. reesei с единым селективным маркером. Разработан протокол замены гайдовых РНК методом Golden Gate, что позволяет итеративно вносить модификации в геном с переиспользованием одного маркера.
• Методы высокопроизводительного скрининга. Анализ каталитических активностей в микропланшетном формате, мутагенез с анализом 500–1000 клонов на раунд.
• Классические методы биохимии и генетической инженерии

Краткая история лаборатории
В конце 2024 года в структуре ЦКП «Промышленные биотехнологии» ФИЦ Биотехнологии РАН была сформирована группа разработки экспрессионных систем под руководством к.х.н. И.Г. Синельникова. В 2025 году на её основе создана лаборатория разработки экспрессионных систем. Лаборатория организована по совместной инициативе Министерства сельского хозяйства Российской Федерации и Министерства науки и высшего образования Российской Федерации для решения прикладных задач в области пищевой биотехнологии — прежде всего разработки отечественных штаммов-продуцентов рекомбинантных ферментов.

ОСНОВНЫЕ ДОСТИЖЕНИЯ

Создана система геномного редактирования на основе CRISPR/Cas9 для нитчатых грибов A. niger и T. reesei, позволяющая осуществлять направленные нокауты, делеции и вставки генов. Система обеспечивает итеративное внесение модификаций с использованием рециркулирующей маркерной системы, что позволяет избегать интеграции «запрещённых» последовательностей в геном штамма.

Получена библиотека мутантных штаммов A. niger с повышенным выходом нативных секретируемых белков за счёт оптимизации секреторного фона — удаления генов внеклеточных протеаз.

Разработана система высокопроизводительного скрининга мутантных штаммов и вариантов ферментов в микропланшетном формате (при помощи роботизированной системы Tecan EVO150). Система позволяет анализировать библиотеки из нескольких сотен клонов за один раунд скрининга и применима как к продуктам рационального дизайна, так и к библиотекам, полученным химическим мутагенезом.

СОСТАВ ЛАБОРАТОРИИ

1. Разработка рекомбинантных штаммов-продуцентов промышленных ферментов на платформах A. niger, T. reesei, P. pastoris
2. CRISPR/Cas9-редактирование геномов нитчатых грибов (нокауты, вставки, замены)
3. Биохимическая характеристика ферментных препаратов (кинетические параметры, термостабильность, pH-профили, субстратная специфичность, операционная стабильность)
4. Роботизированный скрининг и отбор мутантных штаммов с улучшенной продуктивностью