Ключевые слова
стресс, экстремофилы, фоторецепция, фотобиохимия, абиогенез, оксилипины, дифференцировка, эволюция

Направления исследований

• Исследование взаимосвязи накопления активных форм кислорода, функционирования антиоксидантных систем и протекания патологических клеточных процессов у дрожжей различных экологических групп
• Фоторецепция, редокс-сигналинг и защита от окислительного стресса в грибной клетке
• Абиогенез и конструирование супрамолекулярных преобразователей энергии света
• Исследование фотохимии коферментных молекул в моделях абиогенеза, организмах и биотехнологических системах
• Разработка фотобиокатализаторов и энергопреобразующих систем на основе фотосинтетических пигмент-белковых комплексов, ферментов и наноструктурированных неорганических полупроводников
• Изучение бактерицидной и фунгицидной активностей мультифункциональных биоактивных поверхностей с иммобилизованными наносоединениями
• Исследование роли азотного метаболизма в механизме фоторецепции аскомицетов
• Участие различных оксигенированных производных ненасыщенных жирных кислот в процессах дифференцировки грибов. Изучение механизма передачи сигнала оксилипинов у грибов и их локализации у Neurospora crassa
• Исследование механизмов резистентности микроскопических грибов, выделенных из зоны отчуждения ЧАЭС к повышенному радиоактивному излучению на основе сравнительного геномного анализа систем метаболизма чернобыльских грибов и грибов из фоновых экотопов.

Основные методы исследований

• Cформирован и постоянно используется в эксперименте комплекс методов, ориентированных на характеристику фотохимических свойств коферментов; комплекс базируется, в том числе, и на разработанных в лаборатории методах и подходах.
• На основе оценки морфо-функциональных, физиолого-биохимических и генетических особенностей экстремофилов разработан комплексный подход к изучению механизмов адаптации этих уникальных микроорганизмов к неблагоприятным факторам окружающей среды.

Методы фундаментальных исследований:

• поддержание уникальных коллекций отселекционированых и запатентованых штаммов дрожжей-экстремофилов, а также уникальных линий грибов, как мутантных, так и экстремофильных видов, выделенных из природных источников;
• оценка ростовых характеристик дрожжевых культур и цитоморфология микроструктуры клеток;
• определение дыхательной активности, индукции альтернативных путей окисления и общего энергетического статуса клетки методами специфического окрашивания с флуоресцентными потенциометрическими зондами;
• полярографические методы многоканального тестирования параметров клеточной суспензии (в том числе определение концентрации ионов K+ и Ca2+);
• оценка патологических изменений клетки методами флуоресцентной и электронной микроскопии;
• методы определения протеомного состава клетки (2D-электрофорез с последующим масс-спектрометрическим анализом);
• определение активностей антиоксидантных систем дрожжевой клетки полярографическими и спектрофотометрическими методами и детекция скорости генерации активных форм кислорода в клеточной суспензии и субклеточных органеллах дрожжей флуоресцентным методом;
• квантовохимическое моделирование структуры и молекулярной динамики органических молекул (коферментов) в основном, ионизированном и возбужденном состоянии;
• методы разделения органических соединений с помощью разнообразных модификаций ВЭЖХ с использованием набора регистрирующих детекторов, адаптированные к анализу различных коферментов и продуктов их фотохимических реакций;
• методы облучения препаратов и образцов, источниками УФ- и видимого излучения, в том числе, монохроматическим светом;
• методы химического моделирования абиогенеза органических молекул и супрамолекулярных структур;
• характеристики структуры и механизмов действия разрабатываемых фотобиокатализаторов и энергопреобразующих систем методами импульсного лазерного фотолиза, флуоресцентной и абсорбционной спектроскопии, просвечивающей электронной и атомно-силовой микроскопии, электрохимическими и хроматографическими методами;
• количественная оценка светозависимого полового и бесполого развития у дикого типа, штаммов с повреждением азотного метаболизма и мутантов по фоторецепторному комплексу Neurospora crassa в ответ на действие различных соединений;
• комплекс методов для определения характеристик азотного метаболизма Neurospora crassa — активностей ферментов (нитратредуктазы, нитритредуктазы, no синтазы), анализ действия специфических ингибиторов ферментов, динамика выхода нитрита из мицелия в ходе фотоиндуцированного каротиногенеза и фотостимулируемого конидиогенеза;
• оценка бактерицидной и фунгицидной активностей поверхностей с нанопокрытием на плотных питательных средах.

Краткая история лаборатории
Лаборатория в ее нынешнем формате сформирована в 2013 году на основе лаборатории эволюционной биохимии и группы «Биологическое окисление в экстремальных условиях».

ОСНОВНЫЕ ДОСТИЖЕНИЯ

Лаборатория в ее нынешнем формате сформирована в 2013 году на основе лаборатории эволюционной биохимии и группы «Биологическое окисление в экстремальных условиях».

В ходе работы лаборатории были получены следующие результаты:

• Исследована взаимосвязь накопления активных форм кислорода (АФК), функционирования антиоксидантных систем и протекания процесса программируемой клеточной смерти у дрожжей различных экологических групп. На мезофильном штамме дрожжей Endomyces magnusii показано, что значительная активность системы антиоксидантной защиты в дрожжах Е. magnusii может являться фактором, препятствующим нарушению функционирования митохондрий и последующим необратимым изменениям клеточной физиологии. На основе детекции уровня свободных радикалов, генерируемых в клеточной суспензии дрожжей Yarrowia lipolytica, продемонстрированы основные аспекты адаптивной стратегии этого штамма в условиях повышенных рН среды. Показано участие митохондриального компартмента в адаптации клеток дрожжей Y. lipolytica к экстремальным условиям существования, которое затрагивает активную индукцию альтернативной оксидазы митохондрий, наряду с антиоксидантными ферментными системами (главным образом, каталазами), и снижает вредоносное воздействие активных форм кислорода в условиях экстремальных рН.
• Сформированы базовые представления о фотохимии ранее малоисследованного класса биомолекул – птеринов, в том числе, птериновых коферментов. Впервые установлена способность возбужденных молекул птеринов (в том числе, восстановленных форм) вступать в редокс реакции, выяснен механизм ряда реакций, показана генерация птеринами синглетного кислорода, проведена оценка фотоустойчивости и раскрыт механизм фотодеградации ряда коферментов. (Крицкий М.С., Людникова Т.А., Телегина Т.А., Вечтомова Ю.Л., Буглак А.А.). На основании полученных результатов сформулированы гипотезы о роли фотохимических процессов с участием производных птеридина (птеринов и флавинов) в ранней эволюции, в том числе, значения этих процессов как конкурентов хлорофилльного фотосинтеза (М.С.Крицкий). Развиты представления о значении матричных (связанных с поверхностью) фотохимических процессов синтеза органических молекул в абиогенезе (В.А.Отрощенко, Телегина Т.А.). На основе исследования фотохимии птеринов и фолатов предложена и запатентована (2004 г.) новая малозатратная и экологически-дружественная технология синтеза широкопрофильного (прежде всего, используемого в противораковой терапии) лекарственного препарата — кальция фолината (Крицкий М.С,. Телегина Т.А, Вечтомова Ю.Л.).
• В лаборатории разрабатывается новое направление в биокатализе – фотокатализ окислительно-восстановительных процессов при сопряженном безмедиаторном действии неорганических полупроводников и ферментов. Созданы фотобиокатализаторы нового типа на основе наноструктурированных пленок неорганических полупроводников, ферментов и фотосинтетических пигмент-белковых комплексов. Получены фотокатализаторы и разработаны новые способы фотокаталитического получения молекулярного водорода и фотогенерации восстановленных форм никотинамидных и флавиновых коферментов. Разработаны методы иммобилизации ферментов и фотосинтетических пигмент-белковых комплексов в мезопористых полупроводниковых носителях. На разработки в этом направлении получено четыре отечественных патента. За изобретение по патенту РФ № 2322498 Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН награжден Дипломом Роспатента в номинации «100 лучших изобретений России».
• С использованием модельного объекта гриба-аскомицета Neurospora crassa в лаборатории проводятся исследования по изучению роли азотного метаболизма в механизме фоторецепции грибов, возможности регуляции светозависимой дифференцировки грибов при помощи соединений различной природы и оценке фунгицидной активности мультифункциональных биоактивных наноструктурных пленок различного состава.

С 2004 года лаборатория по настоящее время наши исследования поддерживалась Программой фундаментальных исследований Президиума РАН по проблеме эволюции биосферы. В лаборатории получены гранты Министерства образования и науки РФ и РФФИ.

Лаборатория тесно сотрудничает с целым рядом отечественных и зарубежных институтов: МГУ им.М.В. Ломоносова, Институтом физико-химической биологии им.А.Н.Белозерского, ФГУП ГНЦ РФ «ГосНИИгенетика», ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи, РХТУ им. Д.И.Менделеева, Институтом микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Институтом физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН, Институтом биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина (г. Пущино), Институтом теоретической и экспериментальной биофизики РАН (Пущино), Институтом физики Санкт-Петербургского государственного университета, Московским государственным университетом тонких химических технологий имени М.В.Ломоносова, Институтом микробиологии и вирусологии АН Украины им. Д. К. Заболотного, Киев (Украина), Институтом биофизики и клеточной инженерии НАН республики Беларусь (Минск), Department of Applied Chemistry and Microbiology, Viikki Biocenter, Helsinki University, Department of Molecular Neurology, Institute of Biothechnology, prof. N.-E. Saris (Финляндия), Institut fur Medizinische Chemie und Biochemie der Leopold-Franzens Universitat Innsbruck (Австрия).

Сотрудники лаборатории ежегодно участвуют в различных отечественных и международных мероприятиях в качестве экспертов, докладчиков и слушателей. Сотрудники регулярно выступают с устными докладами, в том числе, с приглашенными лекциями, на авторитетных международных и отечественных конференциях и симпозиумах. В 2014 г. лаборатория являлась организатором Международной конференции «Проблема происхождения жизни», посвященной 120-летию со дня рождения выдающегося русского ученого Александра Ивановича Опарина и 90-летию выхода в свет его классической книги «Происхождение жизни».

В лаборатории постоянно ведется работа с молодежью и проводится работа по подготовке молодых специалистов. На базе лаборатории проводится лабораторный практикум по физиологии и биохимии грибов для студентов 4 курса кафедры микологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. Сотрудники лаборатории преподают в Московском Институте Тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова курс лекций по биохимии для магистров 5 и 6 курса Кафедры Химии и технологии биологически активных соединений им. Н.А. Преображенского. За время существования Лаборатории по тематике исследований были защищены 3 бакалаврские и 1 магистерская работы.

Основные научные достижения лаборатории:
1. Создана уникальная коллекция мутантов по регуляции активности ферментов окисления спиртов (Mth-мутантов) и метаболических мутантов метилотрофных дрожжей Pichia methanolica. Разработаны методы генетического и биохимического анализа полученных линий. Изучены регуляторные механизмы биосинтеза и транслокации в пероксисомы основного фермента утилизации метанола алкогольоксидазы. Исследована взаимосвязь между тиоловым статусом клетки и биосинтезом и активностью пероксисомальных ферментов. Показано существование общих регуляторных элементов при функционировании генов AOX1 и CTA1, кодирующих пероксисомальные алкогольоксидазу и каталазу.

2. На основе детекции уровня свободных радикалов, генерируемых в клеточной суспензии дрожжей Y. lipolytica, продемонстрированы основные аспекты адаптивной стратегии этого штамма в условиях повышенных рН среды. Показано участие митохондриального компартмента в адаптации клеток дрожжей Y. lipolytica к экстремальным условиям существования, которое затрагивает активную индукцию альтернативной оксидазы митохондрий, наряду с антиоксидантными ферментными системами (главным образом, каталазами), и снижает вредоносное воздействие активных форм кислорода в условиях экстремальных рН.

3. В нашей лаборатории были выделены и отселекционированы штаммы дрожжей-термофилов: термотолерантных (Candida krusei и Candida blankii, растущих при 39°C и 43°C соответственно) и истинных термофильных (Arxula adeninovorans, имеющих оптимальную температуру культивирования 48-50°C) (патенты № 997459 Родионова Г.С., Исакова Е.П., Брусницына Т.Ю. и др. Штамм дрожжей Candida crusei – продуцент белковой биомассы. Зарег. 14.10.1982; № 1540266 Исакова Е.П., Шерова Т.Л., Салтыкова Л.З. и др. Питательная среда для выращивания дрожжей рода Candida. 1.10.1989). Исследованы и охарактеризованы особенности энергетического обмена термофильных дрожжей Candida blankii и Candida krusei в условиях мезотермии и максимально высоких температур. На термофильных штаммах были показаны высокая степень лабильности мембранных липидов и консервативность энергетического обмена дрожжей, обеспечивающие эффективный рост штаммов в ходе культивирования при высоких температурах (43-45°C).

4. На мезофильном штамме дрожжей Endomyces magnusii показано, что значительная активность системы антиоксидантной защиты в дрожжах Е. magnusii может являться фактором, препятствующим нарушению функционирования митохондрий и последующим необратимым изменениям клеточной физиологии.

5. Выявлены особенности роста и метаболизма 5 штаммов грибов из зоны отчуждения чернобыльской АЭС и 4х штаммов из зон с фоновым уровнем радиоактивного загрязнения.  У грибов из радиационно-загрязненных зон выявлена повышенная устойчивость к окислительному стрессу на фоне низкого содержания глюкозы. Проведена полная аннотация геномов 3х штаммов Purpureocillium lilacinum из чернобыльской зоны и 2х штаммов из зон с фоновым уровнем радиации. Выявлено незначительное изменение генома грибов зоны ЧАЭС по сравнению с грибами из фоновых экотопов.

6. Проведено тестирование полученных в МИТХТ природных аналогов гидроксилированных производных ПНЖК и изучено их действие на рост и размножение Neurospora crassa. Показано, что действие оксигенированных производных характерной для грибов линолевой кислоты на процессы их размножения проявляется сильнее, чем оксилипинов- производных линоленовой и арахидоновой кислот. Фоторецепторный комплекс Neurospora crassa принимает участие в ходе передачи сигнала оксилипинов в ходе полового воспроизведения. Эти исследования перспективны для разработок получения ПНЖК из грибов и выработки стратегии борьбы с паразитными грибами.

7. Проведена сравнительная характеристика антиоксидантных защитных систем (АЗС) дикого типа N.crassa и мутантов по фоторецепторному комплексу. Впервые показана роль альтернативной оксидазы и каталазы как основных АОЗ у мутантных штаммов, что сильно отличает их от дикого типа, у которого АОЗ представлена СОД и каротиноидными пигментами. Это исследование приближает к пониманию трансдукции сигнала АФК у грибов в стрессорных условиях.

8. Показано влияние света на выход нитрата и нитрита (катаболитов NO) из клеток мутантов N.crassa. Выявлена ферментативная активность и обнаружен белок, сходный по ряду свойств с индуцибельными NO-синтазами животных. Результаты важны для оценки роли неорганических регуляторов, в том числе, NO, в клетках N.crassa.

7. Выявлен и исследован цикл редокс-фотореакций биоптерина и его восстановленных производных. Обнаружено различие химического механизма фотовосстановления фолиевой кислоты и неконъюгированных птеринов. Установлен ряд структурно-функциональных особенностей молекул, которые важны как селективные признаки при отборе коферментов на роль фотосенсоров в белках.

9. Показана возможность олигомеризации нуклеозидмонофосфатов и аминокислот, сорбированных на минеральной матрице, предварительно облученной ультрафиолетом.

10. Разработаны методы совместной иммобилизации пигмент-белкового комплекса фотосистемы 1 (ФС1) и ферментов на мезопористом полупроводниковом носителе, полученном из наночастиц диоксида титана. Получены фотобиокатализаторы образования водорода и синтеза восстановленных никотинамидных коферментов под действием ближнего УФ и видимого света на основе ФС1 цианобактерии Synechocystis sp., гидрогеназы Thiocapsa roseopersicina или ферредоксин-NADP-редуктазы шпината, совместно иммобилизованных на нанопористых пленках TiO2.

В лаборатории постоянно ведется работа с молодежью и проводится работа по подготовке молодых специалистов. На базе лаборатории проводится лабораторный практикум по физиологии и биохимии грибов для студентов 4 курса кафедры микологии и альгологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. На той же кафедре читается спецкурс по дифференцировке у грибов, готовятся курсовики и дипломники. Сотрудники лаборатории преподают в Московском Институте Тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова курс лекций по биохимии для магистров 5 и 6 курса Кафедры Химии и технологии биологически активных соединений им. Н.А. Преображенского. За время существования лаборатории по тематике исследований были защищены 3 бакалаврские и 1 магистерская работы.

СОСТАВ ЛАБОРАТОРИИ

УНИКАЛЬНОЕ ОБОРУДОВАНИЕ

1. Aleksey I. Nedoluzhko A.I., I.A. Shumilin I.A., Vitaly V. Nikandrov V.V. Coupled Action of Cadmium Metal and Hydrogenase in Formate Photodecomposition Sensitized by CdS. — The Journal of Physical Chemistry B, 1996, v. 100, p.17544-17550
2. Kritsky M.S., Lyudnikova T.A., Mironov E.A., Moskaleva I.V. The UV radiation-driven reduction of pterins in aqueous solution. — J. Photochem. Photobiol. (B)-Biol, 1997, v.39. №1. p.43-48 (DOI: 10.1016/S1011-1344(96)07451-9)
3. Nikandrov, V.V.; Graetzel, C.K.; Moser, J.E.; Graetzel, M. Light induced redox reactions involving mammalian ferritin as photocatalyst. — J. Photochem. Photobiol., B, 1997, v.41, p. 83-89
4. Bazhenova E.N., Deryabina Yu.I., Eriksson O.,.Zvyagilskaya R.A, Saris N.-E. Characterization of a high-capacity calcium transport system of mitochondria of the yeast Endomyces magnusii. — Journal of Biol. Chem. 1998, V. 273, N 7, p. 4372-4377 (DOI: 10.1074/jbc.273.8.4372)
5. Deryabina Y.I., Bazhenova E.N., Saris N.-E.L., Zvyagilskaya R.A. Ca2+-efflux from mitochondria of the yeast Endomyces magnusii. — Journal of Biol. Chem. 2001, v. 276, p. 47801-47806 (DOI: 10.1074/jbc.M103685200)
6. Grivennikova VG., Serebryanaya DS., Isakova EP., Belozerskaya TA., Vinogradov AD. Active/de-active transition of NADPH:ubiquinone oxidoreductase (Complex 1) in the mitochondrial membrane of Neurospora crassa. — Biochemical Journal, 2003, v. 369, № 3 p.619-626 (DOI: 10.1042/BJ20021165)
7. Emeline A.V., Otroshchenko V.A., Ryabchuk V.K., Serpone N. Abiogenesis and photostimulated heterogeneous reactions in the interstellar medium and on primitive earth: Relevance to the genesis of life. -Journal of Photochemistry and Photobiology. (C) Photochemical Reviews. — 2003, v.34. №4. p.203–224 (DOI: 10.1016/S1389-5567(02)00039-4)
8. Zhukova L.V., Kiwi J., Nikandrov V.V. TiO2 nanoparticles suppress Escherichia coli cell division in the absence of UV irradiation in acidic conditions. — Colloids And Surfaces B: Biointerfaces, 2012, v. 97, p, 240-247 (DOI: 10.1016/j.colsurfb.2012.03.010)
9. Kritsky M.S., Telegina T.A., Vechtomova Y.L., Buglak A.A. Why flavins are not competitors of chlorophyll in the evolution of biological convertors of solar energy. — International Journal of Molecular Sciences, 2013, v.14 № 1. p. 575-593 (DOI: 10.3390/ijms14010575)
10. Sukhorukova I.V., Sheveyko A.N., Kiryukhantsev-Korneev P.V., Zhitnyak I.Y., Gloushankova N.A., Denisenko E.A., Filippovich S.Y., Ignatov S.G., Shtansky D.V. Toward bioactive yet antibacterial surfaces. — Colloids Surf. B Biointerfaces, 2015, v. 135, p. 158-165 (DOI: 10.1016/j.colsurfb.2015.06.059)

1. Тестирование действия различных соединений в качестве регуляторов полового и бесполого циклов развития N. crassa
2. Дизайн и синтез (на основе производных птерина и фолиевой кислоты) соединений, обладающих специфической фармакологической и витаминной активностью
3. Качественный и количественный анализ птеринов и фолатов в химических образцах и биологических объектах