Ключевые слова
стресс, экстремофилы, фоторецепция, фотобиохимия, абиогенез, оксилипины, дифференцировка, эволюция

Направления исследований

• Исследование взаимосвязи накопления активных форм кислорода, функционирования антиоксидантных систем и протекания патологических клеточных процессов у дрожжей различных экологических групп
• Фоторецепция, редокс-сигналинг и защита от окислительного стресса в грибной клетке
• Абиогенез и конструирование супрамолекулярных преобразователей энергии света
• Исследование фотохимии коферментных молекул в моделях абиогенеза, организмах и биотехнологических системах
• Разработка фотобиокатализаторов и энергопреобразующих систем на основе фотосинтетических пигмент-белковых комплексов, ферментов и наноструктурированных неорганических полупроводников
• Изучение бактерицидной и фунгицидной активностей мультифункциональных биоактивных поверхностей с иммобилизованными наносоединениями
• Исследование роли азотного метаболизма в механизме фоторецепции аскомицетов
• Участие различных оксигенированных производных ненасыщенных жирных кислот в процессах дифференцировки грибов. Изучение механизма передачи сигнала оксилипинов у грибов и их локализации у Neurospora crassa
• Исследование механизмов резистентности микроскопических грибов, выделенных из зоны отчуждения ЧАЭС к повышенному радиоактивному излучению на основе сравнительного геномного анализа систем метаболизма чернобыльских грибов и грибов из фоновых экотопов.

Основные методы исследований

• Cформирован и постоянно используется в эксперименте комплекс методов, ориентированных на характеристику фотохимических свойств коферментов; комплекс базируется, в том числе, и на разработанных в лаборатории методах и подходах.
• На основе оценки морфо-функциональных, физиолого-биохимических и генетических особенностей экстремофилов разработан комплексный подход к изучению механизмов адаптации этих уникальных микроорганизмов к неблагоприятным факторам окружающей среды.

Методы фундаментальных исследований:

• поддержание уникальных коллекций отселекционированых и запатентованых штаммов дрожжей-экстремофилов, а также уникальных линий грибов, как мутантных, так и экстремофильных видов, выделенных из природных источников;
• оценка ростовых характеристик дрожжевых культур и цитоморфология микроструктуры клеток;
• определение дыхательной активности, индукции альтернативных путей окисления и общего энергетического статуса клетки методами специфического окрашивания с флуоресцентными потенциометрическими зондами;
• полярографические методы многоканального тестирования параметров клеточной суспензии (в том числе определение концентрации ионов K+ и Ca2+);
• оценка патологических изменений клетки методами флуоресцентной и электронной микроскопии;
• методы определения протеомного состава клетки (2D-электрофорез с последующим масс-спектрометрическим анализом);
• определение активностей антиоксидантных систем дрожжевой клетки полярографическими и спектрофотометрическими методами и детекция скорости генерации активных форм кислорода в клеточной суспензии и субклеточных органеллах дрожжей флуоресцентным методом;
• квантовохимическое моделирование структуры и молекулярной динамики органических молекул (коферментов) в основном, ионизированном и возбужденном состоянии;
• методы разделения органических соединений с помощью разнообразных модификаций ВЭЖХ с использованием набора регистрирующих детекторов, адаптированные к анализу различных коферментов и продуктов их фотохимических реакций;
• методы облучения препаратов и образцов, источниками УФ- и видимого излучения, в том числе, монохроматическим светом;
• методы химического моделирования абиогенеза органических молекул и супрамолекулярных структур;
• характеристики структуры и механизмов действия разрабатываемых фотобиокатализаторов и энергопреобразующих систем методами импульсного лазерного фотолиза, флуоресцентной и абсорбционной спектроскопии, просвечивающей электронной и атомно-силовой микроскопии, электрохимическими и хроматографическими методами;
• количественная оценка светозависимого полового и бесполого развития у дикого типа, штаммов с повреждением азотного метаболизма и мутантов по фоторецепторному комплексу Neurospora crassa в ответ на действие различных соединений;
• комплекс методов для определения характеристик азотного метаболизма Neurospora crassa — активностей ферментов (нитратредуктазы, нитритредуктазы, no синтазы), анализ действия специфических ингибиторов ферментов, динамика выхода нитрита из мицелия в ходе фотоиндуцированного каротиногенеза и фотостимулируемого конидиогенеза;
• оценка бактерицидной и фунгицидной активностей поверхностей с нанопокрытием на плотных питательных средах.

Краткая история лаборатории
Лаборатория в ее нынешнем формате сформирована в 2013 году на основе лаборатории эволюционной биохимии и группы «Биологическое окисление в экстремальных условиях».

ОСНОВНЫЕ ДОСТИЖЕНИЯ

Лаборатория в ее нынешнем формате сформирована в 2013 году на основе лаборатории эволюционной биохимии и группы «Биологическое окисление в экстремальных условиях».

В ходе работы лаборатории были получены следующие результаты:

• Исследована взаимосвязь накопления активных форм кислорода (АФК), функционирования антиоксидантных систем и протекания процесса программируемой клеточной смерти у дрожжей различных экологических групп. На мезофильном штамме дрожжей Endomyces magnusii показано, что значительная активность системы антиоксидантной защиты в дрожжах Е. magnusii может являться фактором, препятствующим нарушению функционирования митохондрий и последующим необратимым изменениям клеточной физиологии. На основе детекции уровня свободных радикалов, генерируемых в клеточной суспензии дрожжей Yarrowia lipolytica, продемонстрированы основные аспекты адаптивной стратегии этого штамма в условиях повышенных рН среды. Показано участие митохондриального компартмента в адаптации клеток дрожжей Y. lipolytica к экстремальным условиям существования, которое затрагивает активную индукцию альтернативной оксидазы митохондрий, наряду с антиоксидантными ферментными системами (главным образом, каталазами), и снижает вредоносное воздействие активных форм кислорода в условиях экстремальных рН.
• Сформированы базовые представления о фотохимии ранее малоисследованного класса биомолекул – птеринов, в том числе, птериновых коферментов. Впервые установлена способность возбужденных молекул птеринов (в том числе, восстановленных форм) вступать в редокс реакции, выяснен механизм ряда реакций, показана генерация птеринами синглетного кислорода, проведена оценка фотоустойчивости и раскрыт механизм фотодеградации ряда коферментов. (Крицкий М.С., Людникова Т.А., Телегина Т.А., Вечтомова Ю.Л., Буглак А.А.). На основании полученных результатов сформулированы гипотезы о роли фотохимических процессов с участием производных птеридина (птеринов и флавинов) в ранней эволюции, в том числе, значения этих процессов как конкурентов хлорофилльного фотосинтеза (М.С.Крицкий). Развиты представления о значении матричных (связанных с поверхностью) фотохимических процессов синтеза органических молекул в абиогенезе (В.А.Отрощенко, Телегина Т.А.). На основе исследования фотохимии птеринов и фолатов предложена и запатентована (2004 г.) новая малозатратная и экологически-дружественная технология синтеза широкопрофильного (прежде всего, используемого в противораковой терапии) лекарственного препарата — кальция фолината (Крицкий М.С,. Телегина Т.А, Вечтомова Ю.Л.).
• В лаборатории разрабатывается новое направление в биокатализе – фотокатализ окислительно-восстановительных процессов при сопряженном безмедиаторном действии неорганических полупроводников и ферментов. Созданы фотобиокатализаторы нового типа на основе наноструктурированных пленок неорганических полупроводников, ферментов и фотосинтетических пигмент-белковых комплексов. Получены фотокатализаторы и разработаны новые способы фотокаталитического получения молекулярного водорода и фотогенерации восстановленных форм никотинамидных и флавиновых коферментов. Разработаны методы иммобилизации ферментов и фотосинтетических пигмент-белковых комплексов в мезопористых полупроводниковых носителях. На разработки в этом направлении получено четыре отечественных патента. За изобретение по патенту РФ № 2322498 Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН награжден Дипломом Роспатента в номинации «100 лучших изобретений России».
• С использованием модельного объекта гриба-аскомицета Neurospora crassa в лаборатории проводятся исследования по изучению роли азотного метаболизма в механизме фоторецепции грибов, возможности регуляции светозависимой дифференцировки грибов при помощи соединений различной природы и оценке фунгицидной активности мультифункциональных биоактивных наноструктурных пленок различного состава.

С 2004 года лаборатория по настоящее время наши исследования поддерживалась Программой фундаментальных исследований Президиума РАН по проблеме эволюции биосферы. В лаборатории получены гранты Министерства образования и науки РФ и РФФИ.

Лаборатория тесно сотрудничает с целым рядом отечественных и зарубежных институтов: МГУ им.М.В. Ломоносова, Институтом физико-химической биологии им.А.Н.Белозерского, ФГУП ГНЦ РФ «ГосНИИгенетика», ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи, РХТУ им. Д.И.Менделеева, Институтом микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Институтом физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН, Институтом биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина (г. Пущино), Институтом теоретической и экспериментальной биофизики РАН (Пущино), Институтом физики Санкт-Петербургского государственного университета, Московским государственным университетом тонких химических технологий имени М.В.Ломоносова, Институтом микробиологии и вирусологии АН Украины им. Д. К. Заболотного, Киев (Украина), Институтом биофизики и клеточной инженерии НАН республики Беларусь (Минск), Department of Applied Chemistry and Microbiology, Viikki Biocenter, Helsinki University, Department of Molecular Neurology, Institute of Biothechnology, prof. N.-E. Saris (Финляндия), Institut fur Medizinische Chemie und Biochemie der Leopold-Franzens Universitat Innsbruck (Австрия).

Сотрудники лаборатории ежегодно участвуют в различных отечественных и международных мероприятиях в качестве экспертов, докладчиков и слушателей. Сотрудники регулярно выступают с устными докладами, в том числе, с приглашенными лекциями, на авторитетных международных и отечественных конференциях и симпозиумах. В 2014 г. лаборатория являлась организатором Международной конференции «Проблема происхождения жизни», посвященной 120-летию со дня рождения выдающегося русского ученого Александра Ивановича Опарина и 90-летию выхода в свет его классической книги «Происхождение жизни».

В лаборатории постоянно ведется работа с молодежью и проводится работа по подготовке молодых специалистов. На базе лаборатории проводится лабораторный практикум по физиологии и биохимии грибов для студентов 4 курса кафедры микологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. Сотрудники лаборатории преподают в Московском Институте Тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова курс лекций по биохимии для магистров 5 и 6 курса Кафедры Химии и технологии биологически активных соединений им. Н.А. Преображенского. За время существования Лаборатории по тематике исследований были защищены 3 бакалаврские и 1 магистерская работы.

Основные научные достижения лаборатории:
1. Создана уникальная коллекция мутантов по регуляции активности ферментов окисления спиртов (Mth-мутантов) и метаболических мутантов метилотрофных дрожжей Pichia methanolica. Разработаны методы генетического и биохимического анализа полученных линий. Изучены регуляторные механизмы биосинтеза и транслокации в пероксисомы основного фермента утилизации метанола алкогольоксидазы. Исследована взаимосвязь между тиоловым статусом клетки и биосинтезом и активностью пероксисомальных ферментов. Показано существование общих регуляторных элементов при функционировании генов AOX1 и CTA1, кодирующих пероксисомальные алкогольоксидазу и каталазу.

2. На основе детекции уровня свободных радикалов, генерируемых в клеточной суспензии дрожжей Y. lipolytica, продемонстрированы основные аспекты адаптивной стратегии этого штамма в условиях повышенных рН среды. Показано участие митохондриального компартмента в адаптации клеток дрожжей Y. lipolytica к экстремальным условиям существования, которое затрагивает активную индукцию альтернативной оксидазы митохондрий, наряду с антиоксидантными ферментными системами (главным образом, каталазами), и снижает вредоносное воздействие активных форм кислорода в условиях экстремальных рН.

3. В нашей лаборатории были выделены и отселекционированы штаммы дрожжей-термофилов: термотолерантных (Candida krusei и Candida blankii, растущих при 39°C и 43°C соответственно) и истинных термофильных (Arxula adeninovorans, имеющих оптимальную температуру культивирования 48-50°C) (патенты № 997459 Родионова Г.С., Исакова Е.П., Брусницына Т.Ю. и др. Штамм дрожжей Candida crusei – продуцент белковой биомассы. Зарег. 14.10.1982; № 1540266 Исакова Е.П., Шерова Т.Л., Салтыкова Л.З. и др. Питательная среда для выращивания дрожжей рода Candida. 1.10.1989). Исследованы и охарактеризованы особенности энергетического обмена термофильных дрожжей Candida blankii и Candida krusei в условиях мезотермии и максимально высоких температур. На термофильных штаммах были показаны высокая степень лабильности мембранных липидов и консервативность энергетического обмена дрожжей, обеспечивающие эффективный рост штаммов в ходе культивирования при высоких температурах (43-45°C).

4. На мезофильном штамме дрожжей Endomyces magnusii показано, что значительная активность системы антиоксидантной защиты в дрожжах Е. magnusii может являться фактором, препятствующим нарушению функционирования митохондрий и последующим необратимым изменениям клеточной физиологии.

5. Выявлены особенности роста и метаболизма 5 штаммов грибов из зоны отчуждения чернобыльской АЭС и 4х штаммов из зон с фоновым уровнем радиоактивного загрязнения.  У грибов из радиационно-загрязненных зон выявлена повышенная устойчивость к окислительному стрессу на фоне низкого содержания глюкозы. Проведена полная аннотация геномов 3х штаммов Purpureocillium lilacinum из чернобыльской зоны и 2х штаммов из зон с фоновым уровнем радиации. Выявлено незначительное изменение генома грибов зоны ЧАЭС по сравнению с грибами из фоновых экотопов.

6. Проведено тестирование полученных в МИТХТ природных аналогов гидроксилированных производных ПНЖК и изучено их действие на рост и размножение Neurospora crassa. Показано, что действие оксигенированных производных характерной для грибов линолевой кислоты на процессы их размножения проявляется сильнее, чем оксилипинов- производных линоленовой и арахидоновой кислот. Фоторецепторный комплекс Neurospora crassa принимает участие в ходе передачи сигнала оксилипинов в ходе полового воспроизведения. Эти исследования перспективны для разработок получения ПНЖК из грибов и выработки стратегии борьбы с паразитными грибами.

7. Проведена сравнительная характеристика антиоксидантных защитных систем (АЗС) дикого типа N.crassa и мутантов по фоторецепторному комплексу. Впервые показана роль альтернативной оксидазы и каталазы как основных АОЗ у мутантных штаммов, что сильно отличает их от дикого типа, у которого АОЗ представлена СОД и каротиноидными пигментами. Это исследование приближает к пониманию трансдукции сигнала АФК у грибов в стрессорных условиях.

8. Показано влияние света на выход нитрата и нитрита (катаболитов NO) из клеток мутантов N.crassa. Выявлена ферментативная активность и обнаружен белок, сходный по ряду свойств с индуцибельными NO-синтазами животных. Результаты важны для оценки роли неорганических регуляторов, в том числе, NO, в клетках N.crassa.

7. Выявлен и исследован цикл редокс-фотореакций биоптерина и его восстановленных производных. Обнаружено различие химического механизма фотовосстановления фолиевой кислоты и неконъюгированных птеринов. Установлен ряд структурно-функциональных особенностей молекул, которые важны как селективные признаки при отборе коферментов на роль фотосенсоров в белках.

9. Показана возможность олигомеризации нуклеозидмонофосфатов и аминокислот, сорбированных на минеральной матрице, предварительно облученной ультрафиолетом.

10. Разработаны методы совместной иммобилизации пигмент-белкового комплекса фотосистемы 1 (ФС1) и ферментов на мезопористом полупроводниковом носителе, полученном из наночастиц диоксида титана. Получены фотобиокатализаторы образования водорода и синтеза восстановленных никотинамидных коферментов под действием ближнего УФ и видимого света на основе ФС1 цианобактерии Synechocystis sp., гидрогеназы Thiocapsa roseopersicina или ферредоксин-NADP-редуктазы шпината, совместно иммобилизованных на нанопористых пленках TiO2.

В лаборатории постоянно ведется работа с молодежью и проводится работа по подготовке молодых специалистов. На базе лаборатории проводится лабораторный практикум по физиологии и биохимии грибов для студентов 4 курса кафедры микологии и альгологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. На той же кафедре читается спецкурс по дифференцировке у грибов, готовятся курсовики и дипломники. Сотрудники лаборатории преподают в Московском Институте Тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова курс лекций по биохимии для магистров 5 и 6 курса Кафедры Химии и технологии биологически активных соединений им. Н.А. Преображенского. За время существования лаборатории по тематике исследований были защищены 3 бакалаврские и 1 магистерская работы.

СОСТАВ ЛАБОРАТОРИИ

УНИКАЛЬНОЕ ОБОРУДОВАНИЕ

1. Cooper AJ, Shurubor YI, Dorai T, Pinto JT, Isakova EP, Deryabina YI, Denton TT, Krasnikov BF. ω-Amidase: an underappreciated, but important enzyme in L-glutamine and L-asparagine metabolism; relevance to sulfur and nitrogen metabolism, tumor biology and hyperammonemic diseases. Amino Acids, 2016, 48(1):1-20.
2. Shurubor YI, Cooper AJ, Isakova EP, Deryabina YI, Beal MF, Krasnikov BF. HPLC determination of α-ketoglutaramate [5-amino-2,5-dioxopentanoate] in biological samples. Anal Biochem. 2016, 494:52-4.
3. Shurubor YI, Cooper AJ, Isakova EP, Deryabina YI, Beal MF, Krasnikov BF. Simultaneous determination of tricarboxylic acid cycle metabolites by high-performance liquid chromatography with ultraviolet detection. Anal Biochem. 2016, 503:8-10.
4. Epova EY,u, Balovneva MV., Isakova EP., Kudykina YK., Zylkova MV., Deryabina YI., Shevelev AB. Expression System for Yarrowia lipolytica Based on a Promoter of the Mitochondrial Potential-dependent Porin VDAC Gene Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2016, 21: 408-413
5. Shurubor YI, D’Aurelio M, Clark-Matott J, Isakova EP, Deryabina YI, Beal MF, Cooper AJL, Krasnikov BF. Determination of Coenzyme A and Acetyl-Coenzyme A in Biological Samples Using HPLC with UV Detection Molecules. 2017, 23;22(9). pii: E1388.
6. Buglak AA, Telegina TA. A theoretical study of 5,6,7,8-tetrahydro-6-hydroxymethylpterin: insight into intrinsic photoreceptor properties of 6-substituted tetrahydropterins.      Photochem Photobiol Sci. 2019;18(2):516-523.
7. Buglak A.A., Telegina T.A., Vorotelyak E.A., Kononov A.I. Theoretical study of photoreactions between oxidized pterins and molecular oxygen. J Photochem Photobiol A. 2019;372:254-259.
8. K.A. Chekanov, E.R. Schastnaya, K. V.Neverov, S. Leu, S. Boussiba, A. Zarka, A.E.Solovchenko. Non-photochemical quenching in the cells of the carotenogenic chlorophyte Haematococcus lacustris under favorable condition and under stress. BBA: General Subjects, 2019, https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2019.05.002

1. Тестирование действия различных соединений в качестве регуляторов полового и бесполого циклов развития N. crassa
2. Дизайн и синтез (на основе производных птерина и фолиевой кислоты) соединений, обладающих специфической фармакологической и витаминной активностью
3. Качественный и количественный анализ птеринов и фолатов в химических образцах и биологических объектах