Лаборатория биоинженерии клеток млекопитающих

Воробьев Иван Иванович
Заведующий лабораторией
доктор биологических наук
ИНБ, комн. 512
Телефон +7 (499) 135-12-29 доб. 229
E-Mail ptichman@gmail.com

Основное

ОПИСАНИЕ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ЛАБОРАТОРИИ

Ключевые слова
Эукариотические продуценты, СНО, редактирование генома, рекомбинантные белки, факторы свёртываемости крови, гормоны

Направления исследований

  1. Изучение фундаментальных механизмов, контролирующих биосинтез и секрецию гетерологичных белков и жизнедеятельность культивируемых клеток млекопитающих.
    Практическое применение:
    Получение высокоэффективных продуцентов биологически активных веществ белковой природы.
  2. Исследования организации клеточного генома и регуляции экспрессии генов на модели культивируемых клеток яичника китайского хомячка.
    Практическое применение:
    Выявление и устранение факторов, которые ограничивают сверхпродукцию секретируемых гетерологичных белков клетками СНО, а также факторов, препятствующих промышленному культивированию плотной культуры клеток СНО, в том числе путей программируемой клеточной гибели и аутофагии.
  3. Фундаментальные исследования в области химии белка и методов математического планирования экспериментов.
    Практическое применение:
    Разработка экономически эффективных и полностью масштабируемых технологий выделения и очистки терапевтических белков фармацевтического качества. Получение конъюгатов терапевтических и вакцинных белков с заданными свойствами.

Основные методы исследований
Лаборатория реализует полный цикл разработки биотехнологических препаратов — от получения высокоэффективных продуцентов до разработки методов выделения целевых белков и контроля их качества. Данный цикл включает как стандартные, так и специфические (в том числе разработанные в лаборатории) методы и подходы.
В лаборатории ведут исследования факторов, ограничивающих продуктивность клеток на разных уровнях – транскрипции, трансляции, секреции, факторов влияющих на выживание клеток в культуре, факторов влияющих на стабильность белковых продуктов в среде и при выделении. Свойства плазмидных векторов и их регуляторных элементов изучают при помощи модельных флуоресцентных белков методами проточной цитометрии и флуориметрии лизатов. Методы биоинформатики используют для анализа интегрированных генов целевых белков и оптимизации кДНК- подбора эффективных для клеток-продуцентов кодонов, определение оптимального количества интронов, а также для анализа состояния геномов полученных клеток-продуцентов.  Линии-продуценты исследуют на предмет подбора оптимальных условий культивирования и стабильности.
В полученных клетках-продуцентах определяют копийность целевого гена, эффективность его транскрипции, трансляции и ход пост-трансляционного процессинга целевого белка. Кроме того, в лаборатории разрабатываются методы очистки целевых белков из среды культивирования до фармакопейных показателей.

Экспериментальные методы:

  • молекулярное клонирование и аналитические методы работы с НК — ПЦР-РВ, саузерн-блот;
  • редактирование генома клеток CHO системой CRISPR-Cas9;
  • получение, культивирование и исследования эффективности и стабильности линий-продуцентов, подбор оптимальных условий для экспрессии целевых белков;
  • микроскопия, проточная цитометрия клеток CHO;
  • иммунохимические методы (ИФА, вестерн-блот, изоэлектрофокусирование);
  • препаративная и аналитическая хроматография белков и пДНК.

Краткая история лаборатории
Лаборатория была основана в 2013 году с целью объединения фундаментальных и прикладных исследований в области фармацевтической биотехнологии. Руководителем лаборатории является д.б.н. Воробьёв И.И.

Достижения

ОСНОВНЫЕ ДОСТИЖЕНИЯ

Основная область исследований лаборатории – разработка методических подходов к получению линий клеток яичника китайского хомячка CHO, продуцирующих фармацевтически значимые гликопротеины в больших количествах.

В лаборатории получены клетки CHO с измененным для этой задачи геномом, а также оригинальный ряд плазмидных векторов, позволяющих осуществлять эффективную интеграцию в эукариотический геном и амплификацию в нём генов целевых белков.

Основные разработки:

Вклад в борьбу с пандемией COVID-19:

  • Разработаны технологии получения внеклеточного домена шиповидного (S) белка SARS-CoV-2 в клетках СНО и нуклеопротеина (NP) SARS-CoV-2 в бактериальных клетках.
  • Разработан суррогатный тест на нейтрализацию вируса (sVNT), основанный на опосредованном антителами блокировании взаимодействия ACE2 и шиповидного белка SARS-CoV-2 RBD.

Терапевтические белки:

В лаборатории получены клеточные линии, секретирующие факторы свертывания крови VIII и IX человека, ряд гетеродимерных гонадотропных гормонов и других гликозилированных белков. В случае фолликулостимулирующего гормона человека (ФСГ) полученная линия-продуцент была использована в полномасштабном промышленном производстве биоаналогового лекарственного препарата Примапур.

Полипептидные гормоны человека для ЗГТ и программ ВРТ:

  • Фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) – получены клетки, секретирующие ФСГ, с продуктивностью превышающей мировые аналоги, разработана процедура выделения и анализа, технология внедрена в производство.
  • Хорионический гонадотропный гормон (ХГ)– получены высокоэффективные клетки-продуценты ХГ, планируется внедрение в производство.
  • Лютеинизирующий гормон (ЛГ) – на примере продуцентов ЛГ отработаны способы балансировки цепей гетеродимера.
  • Тиреотропный гормон (ТТГ) – получены высокоэффективные клетки-продуценты ТТГ.

Рекомбинантные белки системы гемостаза и фибринолиза:

  • Терапия гемофилии А — созданы высокоэффективные клеточные линии, продуцирующие фактор свертывания крови VIII человека с делетированным В-доменом. Разработаны оригинальные методы аффинной очистки рекомбинантного фактора VIII человека.
  • Терапия гемофилии В — разработана технология получения рекомбинантного фактора свертывания крови IX человека в клетках СНО, методы его выделения и контроля качества.
  • Фибринолиз —  разработана линия клеток-продуцентов полноразмерного тканевого активатора плазминогена человека, методы его очистки и контроля качества.

Борьба с ожирением, диабетом и их осложнениями:

  • Сотрудниками лаборатории разработан процесс производства фармацевтической плазмидной ДНК для лечения ишемии нижних конечностей у больных сахарным диабетом.
  • В лаборатории вели изучение биоконъюгированных производных инсулина и человеческого оксинтомодулина. Известно, что такие модификации, как пэгилирование и сиалирование способны повышать время жизни белка в крови пациентов. Поэтому в лаборатории разработан метод получения сиалированного инсулина, позволяющего значительно увеличить периоды между введениями препарата, что улучшает качество жизни пациентов. Также сотрудниками лаборатории был разработан метод получения сиалированного производного пептидного гормона оксинтомодулин, синтезируемый конъюгат продемонстрировал многократное увеличение периода анорексического действия по сравнению с немодифицированным оксинтомодулином.

Сотрудники

СОСТАВ ЛАБОРАТОРИИ

ФИО Ученая степень, звание Должность Место работы Городской телефон Внутренний телефон E-mail
1Воробьев
Иван Иванович
д.б.н., доцентзав. лабораторией, г.н.с.ИНБ, комн. 512(499) 135-12-29229ptichman@gmail.com
2Ковнир
Сергей Владимирович
н.с.ИНБ, комн. 512(495) 308-99-96kovnir.serge@gmail.com
3Орлова
Надежда Александровна
к.б.н.н.с., зам. зав. лабораторииИНБ, комн. 512(495) 308-99-96129nobiol@gmail.com
4Синегубова
Мария Валерьевна
м.н.с.ИНБ, комн. 512(495) 308-99-96129mvsineg@gmail.com
5Ходак
Юлия Александровна
к.б.н.н.с.ИНБ, комн. 512(495) 308-99-96129salix33@gmail.com

 

Разработки

ИННОВАЦИОННЫЕ РАЗРАБОТКИ

Статус Наименование разработки Дата Где Краткое описание
1 Препарат планируется к внедрению Препарат гонадотропного гормона человека (ХГч) (фоллитропин альфа) 2022 ООО «АйВиФарма», Москва Рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон человека стимулирует выработку прогестерона желтым телом и поддерживает развитие плаценты, оказывает гонадотропное действие, преимущественно лютеинизирующее, и используется в программах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Препарат получают в клетках китайского хомячка. В лаборатории получена линия продуцент ХГч, разрабатываются методы выделения и контроля качества белкового препарата.
2 Рекомбинантные антигены SARS-CoV-2 (соответствующие вариантам Ухань, бета, дельта и омикрон) и рецептор
ACE
-2 продаются ФИЦ Биотехнологии РАН
Реагенты для иммунодиагностики  коронавирусной инфекции и псевдовируснейтрализационного теста 2021 ФИЦ Биотехнологии РАН Рекомбинантный внеклеточный домен (RBD) шиповидного (S) белка SARS-CoV-2 и рекомбинантный нуклеопротеин (NP) этого вируса используются для иммунодиагностики коронавирусной инфекции методами ИФА и ИХА.
Рекомбинантный клеточный рецептор
ACE
2 используется для суррогатного теста на нейтрализацию вируса (sVNT), основанного на опосредованном антителами блокировании взаимодействия ACE2 и шиповидного белка SARS-CoV-2 RBD. В лаборатории получены продуценты рекомбинантных антигенов кооронавируса и
ACE
-2, разработаны методы выделения, очистки и варианты постановки иммунодиагностических тестов.
3 Внедрено
(Препарат зарегистрирован, выведен на рынок)
Препарат фолликулостимулирующего гормона человека (ФСГ) Примапур® (фоллитропин альфа) 2019 ООО «АйВиФарма», Москва Рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон человека, используется как стимулятор образования яйцеклеток в организме женщины в программах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Препарат получают в клетках китайского хомячка. В лаборатории получена линия продуцент ФСГ разработаны методы выделения, очистки и контроля качества белкового препарата.
4 Планируется к внедрению Препарат тканевого активатора плазминогена человека (альтеплазы) 2017 НПО «Микроген», Москва Тканевый активатор плазминогена соединяясь с фибрином, стимулирует переход плазминогена в активный плазмин. Препарат на основе рекомбинантного белка используется для тромболизиса. В лаборатории получена линия-продуцент тканевого активатора плазминогена человека и способ его очистки.
5 Препарат успешно прошел доклинические испытания. Патентообладатели ФИЦ Биотехнологии РАН и ИБХ РАН Разработка технологии получения рекомбинантного фактора свертывания крови IX в клетках СНО. (нонаког альфа) 2014 ФИЦ Биотехнологии РАН, ИБХ РАН Рекомбинантный фактор свертывания крови IX человека, используется для терапии гемофилии В. Препарат получают в клетках китайского хомячка. В лаборатории получена линия продуцент фактора IX, разработаны методы выделения, очистки и контроля качества белкового препарата.

Оборудование

УНИКАЛЬНОЕ ОБОРУДОВАНИЕ


Название оборудования/ коллекции Место нахождения
1 Биореактор Sartorius Biostat Cultibag ИНБ, комн. 505
2 Аналитическая система ВЭЖХ Waters Alliance с фотодиодным матричным детектором ИНБ, комн. 514
3 Препаративный хроматограф GE Lifesciences AktaPilot ИНБ, комн. 508
4 Установка для исследования процессов ультрафильтрации GE Lifesciences Akta Crossflow ИНБ, комн. 508

РИД

РЕЗУЛЬТАТЫ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ (патенты, полезные модели, базы данных, ноу-хау и пр.)
Регистрационный номер Тип Название Авторы Заявитель/ патентообладатель Дата приоритета Дата публикации
1 2585532 Патент на изобретение РФ Плазмида для экспрессии рекомбинантного фактора свёртываемости крови IX человека, моноклональная линия клеток млекопитающего — продуцент рекомбинантного фактора свёртываемости крови IX человека и способ получения указанного фактора Ковнир С.В.,
Орлова Н. А.,
Воробьев И. И.,
Ходак Ю. А.,
Дронина М. А.,
Смирнов И. В.,
Пономаренко Н. А.,
Скрябин К. Г.,
Габибов А. Г..
ФИЦ Биотехнологии РАН, ИБХ РАН 31.01.2014 27.05.2016
 2  2560596 Патент на изобретение РФ Плазмида для экспрессии в клетках СНО рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) человека, плазмида для экспрессии в клетках СНО бета-субъединицы рекомбинантного ФСГ человека, клетка СНО — продуцент рекомбинантного ФСГ человека и способ получения указанного гормона Воробьев И.И.,
Орлова Н.А.,
Ковнир С.В.,
Ходак Ю.А.
ООО «АйВиФарма» 24.09.2013 27.03.2015

Публикации

ЗНАЧИМЫЕ ПУБЛИКАЦИИ
  1. Орлова Н. А., Даянова Л. К., Гаямова Е. А., Синегубова М. В., Ковнир С. В., Воробьев И. И. Направленная инактивация генов dhfr, glul, bak1, bax методом мультиплексного геномного редактирования клеток CHO. Доклады Российской академии наук. Науки о жизни, 2022, T. 502, № 1, стр. 54-59 DOI: 10.31857/S2686738922010188.
  2. Kolesov DE, Sinegubova MV, Dayanova LK, Dolzhikova IV, Vorobiev II, Orlova NA. Fast and Accurate Surrogate Virus Neutralization Test Based on Antibody-Mediated Blocking of the Interaction of ACE2 and SARS-CoV-2 Spike Protein RBD. Diagnostics (Basel). 2022 Feb 3;12(2). doi: 10.3390/diagnostics12020393. PubMed PMID: 35204485.
  3. Kolesov DE, Sinegubova MV, Safenkova IV, Vorobiev II, Orlova NA. Antigenic properties of the SARS-CoV-2 nucleoprotein are altered by the RNA admixture. PeerJ. 2022;10:e12751. doi: 10.7717/peerj.12751. eCollection 2022. PubMed PMID: 35036106.
  4. Sinegubova M, Vorobiev I, Klishin A, Eremin D, Orlova N, Orlova N, Polzikov M. Purification Process of a Recombinant Human Follicle Stimulating Hormone Biosimilar (Primapur®) to Yield a Pharmaceutical Product with High Batch-to-Batch Consistency. Pharmaceutics. 2022 Jan 1;14(1). doi: 10.3390/pharmaceutics14010096. PubMed PMID: 35056992.
  5. Sinegubova MV, Orlova NA, Kovnir SV, Dayanova LK, Vorobiev II. High-level expression of the monomeric SARS-CoV-2 S protein RBD 320-537 in stably transfected CHO cells by the EEF1A1-based plasmid vector. PLoS One. 2021;16(2):e0242890. doi: 10.1371/journal.pone.0242890. eCollection 2021. PubMed PMID: 33529230.
  6. Orlova NA, Kovnir SV, Khodak YA, Polzikov MA, Nikitina VA, Skryabin KG, Vorobiev II. High-level expression of biologically active human follicle stimulating hormone in the chinese hamster ovary cell line by a pair of tricistronic and monocistronic vectors. PLoS ONE, 14(7):e0219434, 2019. DOI: 10.1371/journal.pone.0219434.
  7. Kovnir SV, Orlova NA, Shakhparonov MI, Skryabin KG, Gabibov AG, Vorobiev II. A Highly Productive CHO Cell Line Secreting Human Blood Clotting Factor IX. Acta Naturae. 2018 Jan-Mar;10(1):51-65.
  8. Kovnir SV, Orlova NA, Khodak YА, Kondrashova MP, Gabibov AG, Skryabin KG, Vorobiev AI, Vorobiev II. Approaches to Controlled Co-Amplification of Genes for Production of Biopharmaceuticals: Study of the Insertion and Amplification Dynamics of Genetic Cassettes in the Genome of Chinese Hamster Ovary Cells during Co-Expression of Compatible Pair of Plasmids. Bull Exp Biol Med. 2017 Jun;163(2):245-249. doi: 10.1007/s10517-017-3776-0. Epub 2017 Jul 18.
  9. Orlova NA, Kovnir SV, Gabibov AG, Vorobiev II. Stable high-level expression of factor VIII in Chinese hamster ovary cells in improved elongation factor-1 alpha-based system. BMC Biotechnol. 2017 Mar 24;17(1):33. doi: 10.1186/s12896-017-0353-6.
  10. Орлова Н.А., Ковнир С.В., Ходак Ю.А., Ползиков М.А., Воробьев И.И. Рекомбинантный лютеинизирующий гормон человека для терапии бесплодия: получение линий продуцентов. // Акушерство, Гинекология, Репродукция. 2017. Т. 11(3). С. 33-42.
  11. Mokrushina YA, Pipiya SO, Stepanova AV, Shamborant OG, Knorre VD, Smirnov IV, Gabibov AG, Vorobiev II. [Peculiarities of the Mechanism of Interactions of Catalytic Antibodies with Organophosphorus Substrates]. Mol Biol (Mosk). 2017 Nov-Dec;51(6):958-968. doi: 10.7868/S0026898417060088.
  12. И.И. Воробьев, О.В. Проскурина, Ю.А. Ходак, А.И. Государев, А.С. Семихин, Д.В. Бырихина, М.С. Красильщикова, Б.С. Мельник, М.В. Серебрякова, М.А. Ползиков. Физико-химические свойства, токсичность и специфическая активность биоаналогового фоллитропина альфа // Химико-фармацевтический журнал. Том 50, №11, 2016, стр. 35-42.
  13. Smirnov IV, Vorobiev II, Belogurov AA, Genkin DD, Deyev SM, Gabibov AG. Chemical Polysialylation of Recombinant Human Proteins. // Methods Mol Biol. 2015;1321:389-404.
  14. И.И. Воробьев, С.В. Ковнир, Н.А. Орлова, Ю.А. Ходак, М.А. Ползиков. Составы растворов биологически активного рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека // Разработка и регистрация лекарственных средств Т.13, №4, 2015, стр.123-126.
  15. Kolyadko VN, Lushchekina SV, Vuimo TA, Surov SS, Ovsepyan RA, Korneeva VA, Vorobiev II, Orlova NA, Minakhin L, Kuznedelov K, Severinov KV, Ataullakhanov FI, Panteleev MA. New Infestin-4 Mutants with Increased Selectivity against Factor XIIa. PLoS One. 2015 Dec 15;10(12):e0144940. doi: 10.1371/journal.pone.0144940. eCollection 2015.
  16. Orlova NA, Kovnir SV, Vorobiev II, Gabibov AG, Vorobiev AI. Blood Clotting Factor VIII: From Evolution to Therapy. Acta Naturae. 2013 Apr;5(2):19-39.
  17. Orlova NA, Kovnir SV, Hodak JA, Vorobiev II, Gabibov AG, Skryabin KG. Improved elongation factor-1 alpha-based vectors for stable high-level expression of heterologous proteins in Chinese hamster ovary cells. BMC Biotechnol. 2014 Jun 14;14:56. doi: 10.1186/1472-6750-14-56.

Диссертации

ЗАЩИЩЕННЫЕ ДИССЕРТАЦИИ
Диссертант Диссертация Тема работы Научный руководитель/ консультант
Год защиты
1 Воробьев И.И. Докторская
Специальность 03.01.04 Биохимия
Методы функциональной экспрессии генов, кодирующих фармацевтически значимые гликопротеины Скрябин К.Г. 2019
2 Орлова Н.А. кандидатская Дизайн генетических элементов и оптимизация системы гетерологичной экспрессии фактора свёртываемости крови VIII человека в клетках млекопитающих Габибов А.Г. 2013

Услуги

КОНТРАКТНЫЕ УСЛУГИ (которые лаборатория готова оказать на хоздоговорной основе)

1. Клонирование целевых генов во вспомогательные и экспрессионные векторы
2. Трансфекция, наработка биомассы клеток-продуцентов, получение культуральной среды, содержащей целевой продукт
3. Разработка методов очистки целевых белков, очистка, оценка качества полученного препарата методами ВЭЖХ
4. Определение примеси геномной ДНК и белков штамма-продуцента в готовых субстанциях
5. Получение модифицированных белков (пэглирование, сиалирование)