Лаборатория биоинженерии клеток млекопитающих

Воробьев Иван Иванович
Заведующий лабораторией
кандидат химических наук
ИНБ, комн. 512
Телефон +7 (499) 135-12-29 доб. 229
E-Mail ptichman@gmail.com

Основное

ОПИСАНИЕ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ЛАБОРАТОРИИ

Ключевые слова
рекомбинантные белки, эукариотические продуценты, факторы свёртываемости крови, гормоны

Направления исследований

  • Получение высокоэффективных продуцентов биологически активных веществ белковой природы
  • Разработка методов очистки целевых белков
  • Получение модифицированных препаратов белков пролонгированного действия

Основные методы исследований
В рамках исследований лаборатория реализует полный цикл разработки биотехнологических методов  — от получения высокоэффективных продуцентов БАВ, до разработки методов выделения целевых белков. Данный цикл включает как традиционные, так и специальные (в том числе разработанные в лаборатории) методы и подходы.

Методы исследований:

  • анализ, оптимизация и получение генов целевых белков;
  • молекулярное клонирование, методы работы с НК (ПЦР-РВ, саузерн-блот и др.);
  • получение, культивирование и исследования эффективности и стабильности линий-продуцентов, подбор оптимальных условий для экспрессии целевых белков;
  • микроскопические методы исследования линий-продуцентов, в том числе с использованием флуоресцентных белков;
  • хроматографические методы очистки целевых белков;
  • иммунохимические методы анализа эффективности продуцентов и конечных препаратов (ИФА, вестерн-блот);
  • хроматографические методы определения содержания примесей в белковых препаратах

Краткая история лаборатории
Лаборатория была создана в 2013 году по направлению биотехнологии. Руководителем лаборатории является к.б.н. Воробьёв И.И.

Достижения

ОСНОВНЫЕ ДОСТИЖЕНИЯ

Лаборатория занимается разработкой методов получения биологических активных веществ белковой природы, в том числе лекарственных препаратов. Разработанные методы позволяют получать высокоэффективные эукариотические линии-продуценты широкого спектра биологически активных веществ белковой природы, в том числе гормонов, факторов свёртываемости крови, ферментов, терапевтических антител. Эукариотические продуценты, например, клетки эпителия яичника китайского хомячка (СНО), способны осуществлять все необходимые посттрансляционные модификации (обеспечение правильного паттерна гликозилирования, формирование  большого количества дисульфидных связей, отщепление сигнальных участков), которые крайне сложно или невозможно получить при использовании прокариотических продуцентов.

В лаборатории разработан ряд векторов, позволяющих осуществлять эффективную интеграцию в эукариотический геном и амплификацию в нём генов целевых белков, а также обеспечивающих высокий уровень экспрессии целевого полипептида. Оценка эффективности данных генетических конструкций, сохранение их стабильности и целостности в геноме клетки-продуцента, в том числе с помощью рекомбинантных флуоресцентных белков, является фундаментальным направлением исследований лаборатории.

Перед молекулярным клонированием гены целевых белков предварительно анализируют для выбора варианта кДНК, способного обеспечить максимальный уровень транскрипции и трансляции (подбор эффективных для клеток-продуцентов кодонов, определение оптимального количества интронов). В полученных клетках-продуцентах определяют копийность, эффективность трансляции и транскрипции целевого гена. Полученные линии-продуценты исследуют на предмет подбора оптимальных условий культивирования и стабильности. Кроме того, в лаборатории разрабатываются методы очистки целевых белков из среды культивирования, в том числе по фармакопейным стандартам.

В лаборатории разработаны:

  • Высокоэффективные продуценты факторов свёртываемости крови VIII и IX для лечения гемофилии.
  • Продуцент фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) человека, широко использующегося в медицине для лечения бесплодия и при применении вспомогательных репродуктивных технологий, по показателям продуктивности значительно превосходящий известные аналоги.
  • В настоящее время ведётся разработка линии-продуцента фермента альтеплазы (тканевого активатора плазминогена человека), обладающего фибринолитической активностью.

Известно, что такие модификации, как пэгилирование и сиалирование способны повышать время жизни белка в крови пациентов. Поэтому в лаборатории разработан метод получения сиалированного инсулина, позволяющего значительно увеличить периоды между введениями препарата, что улучшает качество жизни пациентов. Также сотрудниками лаборатории ранее был разработан метод получения сиалированного производного пептидного гормона оксинтомодулин, синтезируемый конъюгат продемонстрировал многократное увеличение периода анорексического действия по сравнению с немодифицированн

Сотрудники

СОСТАВ ЛАБОРАТОРИИ

ФИО Ученая степень, звание Должность Место работы Городской телефон Внутренний телефон E-mail
1Воробьев
Иван Иванович
к.х.н., доцентзав. лабораторией, г.н.с.ИНБ, комн. 512(499) 135-12-29229ptichman@gmail.com
2Ковнир
Сергей Владимирович
н.с.ИНБ, комн. 512(495) 308-99-96kovnir.serge@gmail.com
3Орлова
Надежда Александровна
к.б.н.н.с., зам. зав. лабораторииИНБ, комн. 512(495) 308-99-96129nobiol@gmai.com
4Синегубова
Мария Валерьевна
м.н.с.ИНБ, комн. 512(495) 308-99-96129mvsineg@gmail.com
5Ходак
Юлия Александровна
к.б.н.н.с.ИНБ, комн. 512(495) 308-99-96129salix33@gmail.com

 

Разработки

ИННОВАЦИОННЫЕ РАЗРАБОТКИ

Статус Наименование разработки Дата Где Краткое описание
1 Внедрено (вступило в клинические испытания) Препарат фолликулостимулирующего гормона человека (ФСГ) 2015 ООО «АйВиФарма», Москва Продуцент фолликулостимулирующего гормона человека и способ его очистки.
2 Планируется к внедрению Препарат тканевого активатора плазминогена человека (альтеплазы) 2017 НПО «Микроген», Москва Продуцент тканевого активатора плазминогена человека и способ его очистки.

Оборудование

УНИКАЛЬНОЕ ОБОРУДОВАНИЕ


Название оборудования/ коллекции Место нахождения
1 Биореактор Sartorius Biostat Cultibag ИНБ, комн. 505
2 Ферментер Sartorius Biostat B 30 л. с парогенератором ИНБ, комн. 507
3 Аналитическая система ВЭЖХ Waters Alliance с фотодиодным матричным детектором ИНБ, комн. 514
4 Препаративный хроматограф GE Lifesciences AktaPilot ИНБ, комн. 508
5 Установка для исследования процессов ультрафильтрации GE Lifesciences Akta Crossflow ИНБ, комн. 508
6 Четырехканальный автоматический хроматограф GE Lifesciences ИНБ, комн. 508

РИД

РЕЗУЛЬТАТЫ ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ (патенты, полезные модели, базы данных, ноу-хау и пр.)
Регистрационный номер Тип Название Авторы Заявитель/ патентообладатель Дата приоритета Дата публикации
1 2014103168 Заявка РФ Плазмида для экспрессии рекомбинантного фактора свёртываемости крови IX человека, моноклональная линия клеток млекопитающего — продуцент рекомбинантного фактора свёртываемости крови IX человека и способ получения указанного фактора Ковнир С.В.,
Орлова Н. А.,
Воробьев И. И.,
Ходак Ю. А.,
Дронина М. А.,
Смирнов И. В.,
Пономаренко Н. А.,
Скрябин К. Г.,
Габибов А. Г..
ФИЦ Биотехнологии РАН, ИБХ РАН 31.01.2014 10.08.2015
 2  2560596 Патент на изобретение РФ Плазмида для экспрессии в клетках СНО рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) человека, плазмида для экспрессии в клетках СНО бета-субъединицы рекомбинантного ФСГ человека, клетка СНО — продуцент рекомбинантного ФСГ человека и способ получения указанного гормона Воробьев И.И.,
Орлова Н.А.,
Ковнир С.В.,
Ходак Ю.А.
ООО «АйВиФарма» 24.09.2013 27.03.2015

Публикации

ЗНАЧИМЫЕ ПУБЛИКАЦИИ

1. Kovnir SV, Orlova NA, Shakhparonov MI, Skryabin KG, Gabibov AG, Vorobiev II. A Highly Productive CHO Cell Line Secreting Human Blood Clotting Factor IX. Acta Naturae. 2018 Jan-Mar;10(1):51-65.

2. Kovnir SV, Orlova NA, Khodak YА, Kondrashova MP, Gabibov AG, Skryabin KG, Vorobiev AI, Vorobiev II. Approaches to Controlled Co-Amplification of Genes for Production of Biopharmaceuticals: Study of the Insertion and Amplification Dynamics of Genetic Cassettes in the Genome of Chinese Hamster Ovary Cells during Co-Expression of Compatible Pair of Plasmids. Bull Exp Biol Med. 2017 Jun;163(2):245-249. doi: 10.1007/s10517-017-3776-0. Epub 2017 Jul 18.

3. Orlova NA, Kovnir SV, Gabibov AG, Vorobiev II. Stable high-level expression of factor VIII in Chinese hamster ovary cells in improved elongation factor-1 alpha-based system. BMC Biotechnol. 2017 Mar 24;17(1):33. doi: 10.1186/s12896-017-0353-6.

4. Орлова Н.А., Ковнир С.В., Ходак Ю.А., Ползиков М.А., Воробьев И.И. Рекомбинантный лютеинизирующий гормон человека для терапии бесплодия: получение линий продуцентов. // Акушерство, Гинекология, Репродукция. 2017. Т. 11(3). С. 33-42

5. Mokrushina YA, Pipiya SO, Stepanova AV, Shamborant OG, Knorre VD, Smirnov IV, Gabibov AG, Vorobiev II. [Peculiarities of the Mechanism of Interactions of Catalytic Antibodies with Organophosphorus Substrates]. Mol Biol (Mosk). 2017 Nov-Dec;51(6):958-968. doi: 10.7868/S0026898417060088.

6. И. И. Воробьев, О. В. Проскурина, Ю. А. Ходак, А. И. Государев, А. С. Семихин, Д. В. Бырихина, М. С. Красильщикова, Б. С. Мельник, М. В. Серебрякова, М. А. Ползиков, ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА, ТОКСИЧНОСТЬ И СПЕЦИФИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ БИОАНАЛОГОВОГО ФОЛЛИТРОПИНА АЛЬФА // Химико-фармацевтический журнал. Том 50, №11, 2016, стр. 35-42

7. Smirnov IV, Vorobiev II, Belogurov AA, Genkin DD, Deyev SM, Gabibov AG. Chemical Polysialylation of Recombinant Human Proteins. // Methods Mol Biol. 2015;1321:389-404.

8. И. И. Воробьев, С. В. Ковнир, Н.А. Орлова, Ю.А. Ходак, М. А. Ползиков. Составы растворов биологически активного рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека // Разработка и регистрация лекарственных средств Т.13, №4, 2015, стр.123-126.

9. Kolyadko VN, Lushchekina SV, Vuimo TA, Surov SS, Ovsepyan RA, Korneeva VA, Vorobiev II, Orlova NA, Minakhin L, Kuznedelov K, Severinov KV, Ataullakhanov FI, Panteleev MA. New Infestin-4 Mutants with Increased Selectivity against Factor XIIa. PLoS One. 2015 Dec 15;10(12):e0144940. doi: 10.1371/journal.pone.0144940. eCollection 2015.

10. Orlova NA, Kovnir SV, Vorobiev II, Gabibov AG, Vorobiev AI. Blood Clotting Factor VIII: From Evolution to Therapy. Acta Naturae. 2013 Apr;5(2):19-39.

11. Orlova NA, Kovnir SV, Hodak JA, Vorobiev II, Gabibov AG, Skryabin KG. Improved elongation factor-1 alpha-based vectors for stable high-level expression of heterologous proteins in Chinese hamster ovary cells. BMC Biotechnol. 2014 Jun 14;14:56. doi: 10.1186/1472-6750-14-56.

Диссертации

ЗАЩИЩЕННЫЕ ДИССЕРТАЦИИ
Диссертант Диссертация Тема работы Научный руководитель/ консультант
Год защиты
1 Орлова Н.А. кандидатская Дизайн генетических элементов и оптимизация системы гетерологичной экспрессии фактора свёртываемости крови VIII человека в клетках млекопитающих Габибов А.Г. 2013

Услуги

КОНТРАКТНЫЕ УСЛУГИ (которые лаборатория готова оказать на хоздоговорной основе)

1. Клонирование целевых генов во вспомогательные и экспрессионные векторы
2. Трансфекция, наработка биомассы клеток-продуцентов, получение культуральной среды, содержащей целевой продукт
3. Разработка методов очистки целевых белков, очистка, оценка качества полученного препарата методами ВЭЖХ
4. Определение примеси геномной ДНК и белков штамма-продуцента в готовых субстанциях
5. Получение модифицированных белков (пэглирование, сиалирование)