Ключевые слова
Эукариотические продуценты, СНО, редактирование генома, рекомбинантные белки, факторы свёртываемости крови, гормоны

Направления исследований

1. Изучение фундаментальных механизмов, контролирующих биосинтез и секрецию гетерологичных белков и жизнедеятельность культивируемых клеток млекопитающих.
   Практическое применение:
   Получение высокоэффективных продуцентов биологически активных веществ белковой природы.
2. Исследования организации клеточного генома и регуляции экспрессии генов на модели культивируемых клеток яичника китайского хомячка.
   Практическое применение:
   Выявление и устранение факторов, которые ограничивают сверхпродукцию секретируемых гетерологичных белков клетками СНО, а также факторов, препятствующих промышленному культивированию плотной культуры клеток СНО, в том числе путей программируемой клеточной гибели и аутофагии.
3. Фундаментальные исследования в области химии белка и методов математического планирования экспериментов.
   Практическое применение:
   Разработка экономически эффективных и полностью масштабируемых технологий выделения и очистки терапевтических белков фармацевтического качества. Получение конъюгатов терапевтических и вакцинных белков с заданными свойствами.

Основные методы исследований
Лаборатория реализует полный цикл разработки биотехнологических препаратов — от получения высокоэффективных продуцентов до разработки методов выделения целевых белков и контроля их качества. Данный цикл включает как стандартные, так и специфические (в том числе разработанные в лаборатории) методы и подходы.
В лаборатории ведут исследования факторов, ограничивающих продуктивность клеток на разных уровнях – транскрипции, трансляции, секреции, факторов влияющих на выживание клеток в культуре, факторов влияющих на стабильность белковых продуктов в среде и при выделении. Свойства плазмидных векторов и их регуляторных элементов изучают при помощи модельных флуоресцентных белков методами проточной цитометрии и флуориметрии лизатов. Методы биоинформатики используют для анализа интегрированных генов целевых белков и оптимизации кДНК- подбора эффективных для клеток-продуцентов кодонов, определение оптимального количества интронов, а также для анализа состояния геномов полученных клеток-продуцентов.  Линии-продуценты исследуют на предмет подбора оптимальных условий культивирования и стабильности.
В полученных клетках-продуцентах определяют копийность целевого гена, эффективность его транскрипции, трансляции и ход пост-трансляционного процессинга целевого белка. Кроме того, в лаборатории разрабатываются методы очистки целевых белков из среды культивирования до фармакопейных показателей.

Экспериментальные методы:

• молекулярное клонирование и аналитические методы работы с НК — ПЦР-РВ, саузерн-блот;
• редактирование генома клеток CHO системой CRISPR-Cas9;
• получение, культивирование и исследования эффективности и стабильности линий-продуцентов, подбор оптимальных условий для экспрессии целевых белков;
• микроскопия, проточная цитометрия клеток CHO;
• иммунохимические методы (ИФА, вестерн-блот, изоэлектрофокусирование);
• препаративная и аналитическая хроматография белков и пДНК.

Краткая история лаборатории
Лаборатория была основана в 2013 году с целью объединения фундаментальных и прикладных исследований в области фармацевтической биотехнологии. Руководителем лаборатории является д.б.н. Воробьёв И.И.

ОСНОВНЫЕ ДОСТИЖЕНИЯ

Основная область исследований лаборатории – разработка методических подходов к получению линий клеток яичника китайского хомячка CHO, продуцирующих фармацевтически значимые гликопротеины в больших количествах.

В лаборатории получены клетки CHO с измененным для этой задачи геномом, а также оригинальный ряд плазмидных векторов, позволяющих осуществлять эффективную интеграцию в эукариотический геном и амплификацию в нём генов целевых белков.

Основные разработки:

Вклад в борьбу с пандемией COVID-19:

• Разработаны технологии получения внеклеточного домена шиповидного (S) белка SARS-CoV-2 в клетках СНО и нуклеопротеина (NP) SARS-CoV-2 в бактериальных клетках.
• Разработан суррогатный тест на нейтрализацию вируса (sVNT), основанный на опосредованном антителами блокировании взаимодействия ACE2 и шиповидного белка SARS-CoV-2 RBD.

Терапевтические белки:

В лаборатории получены клеточные линии, секретирующие факторы свертывания крови VIII и IX человека, ряд гетеродимерных гонадотропных гормонов и других гликозилированных белков. В случае фолликулостимулирующего гормона человека (ФСГ) полученная линия-продуцент была использована в полномасштабном промышленном производстве биоаналогового лекарственного препарата Примапур.

Полипептидные гормоны человека для ЗГТ и программ ВРТ:

• Фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) – получены клетки, секретирующие ФСГ, с продуктивностью превышающей мировые аналоги, разработана процедура выделения и анализа, технология внедрена в производство.
• Хорионический гонадотропный гормон (ХГ)– получены высокоэффективные клетки-продуценты ХГ, планируется внедрение в производство.
• Лютеинизирующий гормон (ЛГ) – на примере продуцентов ЛГ отработаны способы балансировки цепей гетеродимера.
• Тиреотропный гормон (ТТГ) – получены высокоэффективные клетки-продуценты ТТГ.

Рекомбинантные белки системы гемостаза и фибринолиза:

• Терапия гемофилии А — созданы высокоэффективные клеточные линии, продуцирующие фактор свертывания крови VIII человека с делетированным В-доменом. Разработаны оригинальные методы аффинной очистки рекомбинантного фактора VIII человека.
• Терапия гемофилии В — разработана технология получения рекомбинантного фактора свертывания крови IX человека в клетках СНО, методы его выделения и контроля качества.
• Фибринолиз —  разработана линия клеток-продуцентов полноразмерного тканевого активатора плазминогена человека, методы его очистки и контроля качества.

Борьба с ожирением, диабетом и их осложнениями:

• Сотрудниками лаборатории разработан процесс производства фармацевтической плазмидной ДНК для лечения ишемии нижних конечностей у больных сахарным диабетом.
• В лаборатории вели изучение биоконъюгированных производных инсулина и человеческого оксинтомодулина. Известно, что такие модификации, как пэгилирование и сиалирование способны повышать время жизни белка в крови пациентов. Поэтому в лаборатории разработан метод получения сиалированного инсулина, позволяющего значительно увеличить периоды между введениями препарата, что улучшает качество жизни пациентов. Также сотрудниками лаборатории был разработан метод получения сиалированного производного пептидного гормона оксинтомодулин, синтезируемый конъюгат продемонстрировал многократное увеличение периода анорексического действия по сравнению с немодифицированным оксинтомодулином.

СОСТАВ ЛАБОРАТОРИИ

ИННОВАЦИОННЫЕ РАЗРАБОТКИ

УНИКАЛЬНОЕ ОБОРУДОВАНИЕ

1. Клонирование целевых генов во вспомогательные и экспрессионные векторы
2. Трансфекция, наработка биомассы клеток-продуцентов, получение культуральной среды, содержащей целевой продукт
3. Разработка методов очистки целевых белков, очистка, оценка качества полученного препарата методами ВЭЖХ
4. Определение примеси геномной ДНК и белков штамма-продуцента в готовых субстанциях
5. Получение модифицированных белков (пэглирование, сиалирование)