Информация о проектах ФЦП ИиР 2014-2020

Проекты, выполняемые Институтом биохимии им. А.Н. Баха, в рамках
ФЦП «
Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2014-2020 годы»

 

Проект:  Разработка прогноза реализации приоритета научно-технологического развития, определенного пунктом 20г «Переход к высокопродуктивному и экологически чистому агро- и аквахозяйству, разработку и внедрение систем рационального применения средств химической и биологической защиты сельскохозяйственных растений и животных, хранение и эффективную переработку сельскохозяйственной продукции, создание безопасных и качественных, в том числе функциональных, продуктов питания» Стратегии научно-технологического развития Российской Федерации
Номер проекта: 14.601.21.0016
Мероприятие ФЦП: 1.1
Руководитель работ: Попов Владимир Олегович
Сроки выполнения: 23.10.2017 — 30.06.2019
Общий объем бюджетного и привлеченного финансирования: 22.475 млн. руб.

V

Разработка прогноза реализации следующих приоритетных направлений научно-технологического развития Российской Федерации:
— переход к высокопродуктивному и экологически чистому агро- и аквахозяйству,
— разработка и внедрение систем рационального применения средств химической и биологической защиты сельскохозяйственных растений и животных,
— хранение и эффективная переработка сельскохозяйственной продукции,
— создание безопасных и качественных, в том числе функциональных, продуктов питания.

Прогноз должен быть сформирован с учётом имеющегося потенциала (кадрового, инфраструктурного, производственного, логистического и т.д.) и коммуникационных возможностей на территории Российской Федерации, а также возможных международных (экстерриториальных) связей с научным, инженерным и предпринимательским сообществом отдельных стран и (или) макрорегионов.

V

1.1. Разработаны анкеты для проведения экспертных опросов и глубинных интервью по Приоритету.

1.2. Построена  аналитическоая карта, отражающая  рынки (сектора экономики), развитие которых обеспечивается реализацией приоритета; ключевые технологии, ожидаемые в рамках реализации приоритета, а также областей науки и техники, развитие которых может обеспечить его реализацию.

1.3. Осуществлена оценка качественных и, в случае возможности определения – количественных параметров рынков продуктов и (или) услуг, значимых социальных задач, развитие которых обеспечивается при реализации Приоритета.

1.4. Подготовлен предварительный перечень законодательных и социальных барьеров для развития рынков товаров, услуг и технологий.


Проект: Дизайн, синтез и исследование механизма действия новых оригинальных гетероциклических соединений обладающих активностью в отношении не реплицирующихся форм туберкулеза
Номер проекта: 14.616.21.0065
Мероприятие ФЦП: 2.2
Руководитель работ: Макаров Вадим Альбертович
Сроки выполнения: 2016 — 2018 гг
Иностранный партнер: Комениус Университет, г. Братислава, Словакия
Общий объем бюджетного и привлеченного финансирования: 30,0 млн. руб

V

Основной целью совместного проекта является изучение взаимосвязи структуры и противотуберкулезной активности новых соединений – производных 2-тиопиридинов, тиенопиримидинов и пираноиндолов, дизайн и синтез соединений в этих трех рядах и комплексное исследование их влияния на метаболизм микобактерий и противотуберкулезную активность в in vitro и in vivo моделях.

Для достижения поставленной цели необходимо решение ряда задач:

  • синтезировать новые производные в трех рядах соединений — 2-тиопиридинов, тиенопиримидинов и пираноиндолов, среди которых уже выявлены соединения обладающие целевой активностью:
  • исследовать противотуберкулезную активность полученных соединений как на растущих, так и на не делящихся клетках:
  • изучить взаимосвязь между структурой и активностью и на основе полученных данных синтезировать наиболее активные соединения, которые могли бы быть подвергнуты углубленному изучению как кандидаты в лекарственное средство:
  • выявить их молекулярной мишени и механизм действия в клетке M. tuberculosis что является на сегодняшний день обязательным условием успешного развития нового препарата.

V

Проанализированы последние достижения в области создания соединений с противотуберкулезной активностью. Рассмотрено современное состояние терапии туберкулеза. Анализ основных направлений исследований в области создания соединений с противотуберкулезной активностью показал, что наиболее перспективным путем создания новых высокоэффективных препаратов является комплексный подход, включающий скрининг соединений в отношении как полноклеточных форм микобактерий, так и в отношении дормантных форм, подробное генетическое исследование резистентных мутантных штаммов и проведение секвенирования чувствительных штаммов микобактерий, подвергнувшихся обработке препаратами для поиска потенциальных мишений.

Проведены патентные исследования по ГОСТ 15.011-96. Отчет о проведенных патентных исследованиях по теме «Лекарственные средства на основе 2-тиопиридина, тиенопиримидина и пираноиндола, для лечения туберкулеза» представлен в составе отчетной документации 1-го этапа отдельным документом.

Проведено теоретическое исследование путей создания новых противотуберкулезных препаратов. Показано, что только комплексный подход к направленному поиску противотуберкулезных препаратов нового поколения имеет шансы на успех. Такое направление исследований должно включать как скрининг в отношении полноклеточных форм микобактерий, так и скрининг в отношении дормантных форм с одной стороны, и подробное генетическое исследование, как резистентных мутантных штаммов, так и чувствительных штаммов, подвергнувшихся обработке.

Осуществлен дизайн и синтез новых производных в двух рядах соединений – 2-тиопиридинов (34 соединения) и пираноиндолов (35 соединений).

Проведено тестирование физико-химических свойств 34-х синтезированных соединений производных 2-тиопиридина и 35-ти синтезированных соединений производных пираноиндола. На основе проведенных работ разработаны протоколы тестирования физико-химических свойств образцов соединений производных 2-тиопиридина и пираноиндола, которые представлены в составе отчетной документации 1-го этапа отдельным документом.

Получена библиотека соединений производных 2-тиопиридина, включающая 34 соединения и библиотека соединений производных пираноиндолов, включающая 35 соединений. Каждое вещество из библиотек соединений охарактеризовано по своим физико-химическим свойствам, в том числе данными 1Н ЯМР, данным элементного анализа (CHN-анализ), данным масс-спектрометрии, данным ИК- спектроскопии.

Проведено изучение цитотоксичности полученных соединений производных 2-тиопиридина и пираноиндола в отношении клеточных линий карциномы легкого человека (А-549) и HepG2.

Проведено исследование противотуберкулезной активности полученных соединений производных 2-тиопиридина и пираиндола как на растущих (штамм Mycobacterium tuberculosis H37Rv), так и на не делящихся клетках (штамм Mycobacterium tuberculosis ss18b). Изучена взаимосвязь между структурой синтезированных соединений и их противотуберкулезной активностью. Было установлено, что несколько 1-гидрокси-2-тиопиридинов с фрагментом изотиомочевины во втором положении проявляют высокую активность в отношении лабораторного штамма микобактерий туберкулеза H37Rv. Исследование влияния различных заместителей во фрагменте изотиомочевины в положении 5 пиридинового кольца показало, что соединения с тетрагидропиримидиновым остатком проявляли чуть менее выраженную противотуберкулезную активность, по сравнению с их близкими аналогами – соединениями, имеющими меньший размер цикла заместителя. При этом не наблюдается никакой противотуберкулезной активности для соединений с атомами H, Me или Cl в положении 5 пиридинового кольца 4а-с (МИК > 100 мкг/мл). Только соединения, имеющие в этом положении сильный электроноакцепторный заместитель, такой как алкоксикарбонил или трифторметил группы, проявляли высокую противотуберкулезную активность. В результате проведенного in vitro скрининга были отобраны 10 соединений лидеров производных 2-тиопиридина и 5 соединений лидеров производных пираноиндола для дальнейшего углубленного изучения в качестве кандидатов для создания лекарственного средства.

Для выявления молекулярной мишени в клетке M. tuberculosis и механизма действия соединений лидеров – кандидатов в лекарственное средство для лечения туберкулеза на данном этапе выполнения работ словацким пратнером была разработана аналитическая платформа, включающая результаты оптимизации определения МИК для не патогенных модельных организмов Mycobacterium tuberculosis H37Ra и Mycobacterium bovis BCG, результаты оптимизации условий введения радиоактивной метки в различных средах, результаты оптимизации аналитических методов для мониторинга введения радиоактивной метки в ДНК, РНК, белки, клеточную стенку и нуклеотиды, результаты оптимизации определения градиента протонов в микобактериях, а также результаты валидации разработанных методических подходов на примере противотуберкулезных препаратов с известным механизмом действия.


Проект: Создание отечественных ферментных препаратов нового поколения, обладающих улучшенными эксплуатационными характеристиками, для применения в кормопроизводстве
Номер проекта: 14.607.21.0159
Мероприятие ФЦП: 1.3
Руководитель работ: Синицын Аркадий Пантелеймонович
Сроки выполнения: 2016 — 2018 гг.
Индустриальный партнер: ООО «Агрофермент» (Тамбовская обл.)
Общий объем бюджетного и привлеченного финансирования: 61,8 млн. руб

V

По окончании первого этапа выполнения работ по Соглашению о субсидии №14.607.21.0159 от 03 октября 2016 г. были достигнуты следующие результаты:

  • Проведен аналитический обзор научно-технической, нормативной и методической литературы, относящейся к тематике создания ферментных препаратов для кормопроизводства с необходимыми эксплуатационными характеристиками. В обзоре задействовано более 50-ти современных научно-технических ссылок.
  • Проведены патентные исследования на тему разработки комплексных ферменных препаратов ксиланаз- целлюлаз. Показано преимущество выбранных в проекте технических решений.
  • Проведены теоретические исследования уровня зарубежных и отечественных разработок в области применения ферментных препаратов в кормах моногастричных животных.
  • Определены ключевые физико-химические и биохимические параметры ферментных препаратов, влияющих на функциональные свойства кормов. К ним относятся- каталитическая активность и термостабильность.
  • Разработаны две лабораторные методики тестирования эксплуатационных характеристик разрабатываемых ферментных препаратов в том числе: методика определения целевых активностей ферментных препаратов в составе кормов и определения вязкости кормов на основе стандартных рецептур для кормления с/х животных и птицы; методика определения операционной стабильности ферментных препаратов, используемых в кормопроизводстве.


Проект: Использование возможностей Европейского Центра Синхротронного Излучения для исследования пространственной организации архитектурных белков D.melanogaster и их комплексов
Номер проекта: 14.616.21.0066
Мероприятие ФЦП: 2.2
Руководитель работ: Попов Владимир Олегович
Сроки выполнения: 2016 — 2017 гг.
Общий объем бюджетного и привлеченного финансирования: 15.310 млн. руб.

V

Целью проекта является изучение пространственной организации архитектурных белков (и/или их доменов), а также их функциональных комплексов, контролирующих архитектуру генома и обеспечивающих регуляцию экспрессии генов у дрозофилы D.melanogaster.

Реализация проекта будет способствовать расширению знаний и получению новых значимых научных результатов в области структурной биологии. Для достижения указанной цели планируется совместное использование станции «Белок» НИЦ «Курчатовский институт» и ряда станций Европейского центра синхротронного излучения в части проведения рентгеноструктурного эксперимента и эксперимента по малоугловому рентгеновскому рассеянию.

Проект выполняется под руководством ведущего ученого-координатора: заместителя руководителя группы Структурной биологии Европейского центра синхротронного излучения Кристофа Мюллера-Дикмана (Christoph Müller-Dieckmann).

V

  1. Проведен аналитический обзор современной научно-технической литературы, а также патентные исследования в соответствии с ГОСТ Р 15.011-96.
  2. Созданы генетические конструкции для отобранных архитектурных белков (и/или их структурных доменов) из D.melanogaster. Проведена экспрессия целевых белков в системе E.coli.
  3. Выделен и очищен ряд исследуемых белков для последующих структурных исследований.
  4. Проведен функциональный тест ряда полученных целевых белков на предмет образования комплексов и/или мультимеризации.
  5. Проведен широкий скрининг и оптимизация условий кристаллизации полученных белковых объектов.
  6. Получены белковые кристаллы для двух исследуемых объектов.
  7. Проведено тестирование образцов белковых кристаллов для условий рентгеноструктурного эксперимента на станции «Белок» НИЦ КИ.
  8. С использованием возможностей Европейского Центра Синхротронного Излучения (ESRF) были получены следующие результаты:

Получены пространственные структуры BTB-домена белка Centrosomal Protein 190 (разрешение 1.4А) и ZAD-домена белка Serendipity (разрешение 3.5А). Методом SAXS получены данные низкого разрешения для ZAD-домена белка CG1832, подтвердившие, что белок в растворе представляет собой гомодимер.


Проект: Исследование пространственной структуры белков, контролирующих архитектуру генома и регуляцию экспрессии генов у эукариот, с использованием возможностей Европейского центра синхротронного излучения
Номер проекта: 14.616.21.0045
Мероприятие ФЦП: 2.2
Руководитель работ: Попов Владимир Олегович
Сроки выполнения: 2015 г.
Общий объем бюджетного и привлеченного финансирования: 8.349 млн. руб.

V

1. Пространственная организация генома имеет важное значение в процессах поддержания архитектуры ядра и регуляции всех процессов, происходящих в нем. Известно, что в процесс регуляции транскрипции у эукариот вовлечены многочисленные элементы генома, зачастую расположенные на значительном расстоянии друг от друга. В последние несколько лет была сформирована концепция, согласно которой существует особый класс архитектурных белков, в числе которых и известные инсуляторные белки, участвующих в организации общей архитектуры хромосом, а также в локальном контроле энхансер-промоторных взаимодействий. Предполагается, что данные белки способны устанавливать дистанционные взаимодействия, а также привлекать различные белковые многокомпонентные комплексы, которые, в частности, могут менять статус окружающего хроматина, однако соответствующие структурные данные и механизмы действия архитектурных белков до сих пор неизвестны. Исходя из этого, особый интерес представляют те архитектурные белки, которые способны, напрямую или путем привлечения других белков-партнеров, формировать белковые комплексы. Данное свойство, с одной стороны, делает возможным специфичное и эффективное сближение дистанционно разделенных регуляторных элементов генома, а с другой — позволяет разделять хроматиновые домены за счет образования хромосомальных петель. Очевидный недостаток структурной информации существенно тормозит развитие исследований в части изучения пространственной организации генома и механизмов регуляции экспрессии генов. Помимо фундаментальной составляющей, такие данные имеют и прикладной интерес. Так, известно, что нарушения, происходящие на уровне архитектуры хромосом, часто напрямую связаны с развитием многих заболеваний человека. Полученные в результате выполнения проекта структурные данные позволят глубже исследовать механизмы протекания заболеваний, связанных с такими нарушениями архитектуры хромосом как, например, онкогенные хромосомные перестройки.

2. Целью проекта является исследование пространственных структур белков эукариот, контролирующих архитектуру их генома и обеспечивающих регуляцию экспрессии генов. Для этой цели будут использованы возможности Европейского центра синхротронного излучения в части проведения рентгеноструктурного эксперимента.

V

При выполнении работ по проекту были получены следующие результаты:

1. Отобран пять архитектурных белков из модельного организма D.melanogaster (включая их структурные домены).
2. Отобранные белки получены в количестве и с чистотой, пригодной для их структурных исследований методом рентгеноструктурного анализа.
3. Проведен широкий скрининг условий кристаллизации полученных белков. Выращены кристаллы для двух белковых объектов.
4. С использованием инфраструктуры ESRF получена пространственная структура BTB-домена белка CP190 с разрешением 2.5А, а для ZAD-домена белка CG17958 получены диффрационные наборы с разрешением 3.67А.
5. Структура BTB-домена белка CP190 решена и уточнена.


Проект: Проведение исследований и развитие приборной базы ЦКП «Промышленные биотехнологии»
Номер проекта: 14.621.21.0002
Мероприятие ФЦП: 3.1.2
Руководитель работ: Попов Владимир Олегович
Сроки выполнения: 2014-2015 гг.
Общий объем бюджетного и привлеченного финансирования: 73.4 млн. руб.

V

1. реализация Программы развития ЦКП «Промышленные биотехнологии» ИНБИ РАН (далее – ЦКП) на 2014-2015 годы направленной на повышение эффективности участия центра в реализации перспективных междисциплинарных исследовательских проектов по приоритетным направлениям развития науки и технологий Российской Федерации, решений перспективных научных задач, в том числе в кооперации с ведущими мировыми научными и исследовательскими центрами;

2. повышение уровня сложности и расширения перечня выполняемых научно-технических услуг, а также развитие нормативно-методической, метрологической и информационной составляющих ЦКП.

V

1.Закуплен комплекс оборудования для жидкостной хроматографии, включающий из тандемный масс-спектрометр и комплекс лабораторных автоклавируемых ферментеров

2.Выполнен аналитический обзор литературы, обоснование и выбор наиболее эффективных методов и средств, направления исследований и способов решения ПНЗ «Разработка новых методов переработки и использования возобновляемого и техногенного сырья»

3.Разработана перспективная программа развития ЦКП

4.Разработаны методики выделения и получения препаратов технических ферментов и идентификации секретируемых продуктов и метаболитов

5.Проведены исследования для внешних пользователей

6.Проведен вебинар и практические занятия со студентами

7.Проведены работы за счет внебюджетных средств: подготовлены помещения для установки оборудования, проведена калибровка и поверка оборудования


Проект: Биотехнологическая конверсия растительного сырья в карбоновые, молочную и фумаровую, кислоты для их использования в синтезе биополимеров
Номер проекта: 14.607.21.0050
Мероприятие ФЦП: 1.3
Руководитель работ: Синицын Аркадий Пантелеймонович
Сроки выполнения: 2014–2016 гг.
Общий объем бюджетного и привлеченного финансирования: 97 млн. руб.

V

Объектом разработки является новая технологическая схема получения карбоновых кислот, в частности фумаровой и молочной кислоты, объединяющая два процесса- ферментативную конверсию некрахмального растительного сырья в простые сахара и микробиологическую трансформацию получаемых сахаров в карбоновые кислоты.
Новизна разработки заключается в 1) анализе реакционной способности нескольких видов некрахмальной растительной биомассы, являющейся отходами деревообрабатывающей промышленности и сельского хозяйства, 2) создании новой серии ферментных препаратов для деградации целлюлозо- и инулосодержащего сырья, 3) использовании модифицированных микроорганизмов в стадии биосинтеза карбоновых кислот, 4) анализе возможностей удешевления процесса переработки некрахмального сырья в карбоновые кислоты с применением ферментативных технологий.
Результаты предлагаемой разработки будут апробированы на базе пилотного биотехнологического производства «Краснодарский биоцентр», г.Абинск, Краснодарский край.

V

— проведен аналитический обзор современной научно-технической литературы, затрагивающей тему переработки непищевой растительной биомассы в сахара и, далее, в карбоновые кислоты. Количество используемых источников — 184 ссылки;
— разработан план экспериментальных исследований;
— разработаны 7 лабораторных методик, позволяющих адекватно оценить эффективность стадий процесса переработки некрахмального растительного сырья в конечную продукцию- карбоновые кислоты;
— проведены экспериментальные исследования по созданию рекомбинантных штаммов-продуцентов карбогидраз и инулиназ. Получены трансформанты;
— проведены патентные исследования по двум объектам «Штамм мицелиального гриба Penicillium verruculosum – продуцент комплекса ферментов карбогидраз, деградирующих инулосодержащее сырье» и «Способ получения комплексного ферментного препарата, содержащего инулиназы и целлюлазы для биоконверсии инулосодержащего сырья».

V

— Получено 4 экспериментальных образца рекомбинантных штаммов инулиназ. В результате исследования их гидролитической способности на предобработанных клубнях и стеблях топинамбура выбрано 2 из них- Penicillium verruculosun INU13 и Penicillium verruculosum INU18.
— Наработаны 7 экспериментальных образцов сухих ферментных препаратов, включая инулолитические и целлюлолитические ферментные препараты.
— Наработаны 3 экпериментальных образца биокатализатора получения фумаровой кислоты, представляющие собой гриб Rhizopus oryzae F-1032.
— Наработаны 6 экпериментальных образцов биокатализаторов получения молочной кислоты, 3 из которых на основе бактериальных L. casei В-3960 и 3 из которых на основе грибного штамма Rhizopus oryzae F-814. Оба биокатализатора были иммобилизованы на поливиниловом спирте.
— Разработаны Программы и методики испытаний экспериментальных образцов новых ферментных препаратов для гидролиза предобработанного сырья на лабораторном оборудовании, а также образцов молочной и фумаровой кислот в новых гидролизных средах.
— Наработаны партии предобработанного растительного сырья для проведения ферментативного гидролиза. Получено 5 образцов. Использованы физико-химические методы предобработки, а именно: 1) получена партия механически измельченного свекловичного жома, 2) партия механически измельченных клубней топинамбура, 3) партия стеблей топинамбура, обработанного органозольвом, а также партия 4) стеблей топинамбура и 5) измельченных осиновых опилок, обработанных кислотой.
— Наработаны партии ферментных препаратов в объемах 10 л культуральной жидкости.
— Наработаны партии гидролизатов предобработанного растительного сырья с разными комбинациями ферментных препаратов. Всего получено 16 образцов гидролизатов. Показано, что для наработки конечного продукта фумаровой и молочной кислоты наиболее перспективным и экологически чистым сырьем являются измельченные клубни топинамбура.
— Наработаны и испытаны партии фумаровой и молочной кислоты в новых гидролизных средах в соответствии с разработанными ПМ.

V

— Проведено исследование экспериментальных образцов новых ферментных препаратов и описаны их свойства. Определен компонентный состав новых ферментных препаратов INU13 и INU18, полученных на основе культуральной жидкости рекомбинантных штаммов P.verruculosum PVERINU13 и P.verruculosum PVERINU18. Показано, что ферментный препарат INU13 содержит 45% целевой гетерологичной инулиназы Asp.awamori, в то время как препарат INU18 – 28,5%.
— Были определены биохимические свойства ферментных препаратов INU13 и INU18 такие как рН-оптимум, Т-оптимум и термостабильность препаратов при стандартном наборе температур (50, 55, 60, 65 и 70С). Все эти характеристики определяют операционную стабильность новых ферментных препаратов, которая является основной эксплутационной характеристикой при использовании на производстве. Показано, что, рН оптимум препаратов равен 5, T-оптимум – 60С по инулину топинамбура. Также показано, что препарат INU13 является более стабильным в условиях повышенных температур, чем препарат INU18.
— Было проведено исследование экспериментальных образцов штаммов микроорганизмов-продуцентов фумаровой кислоты в новых гидролизных средах. Анализ установленных концентраций побочных продуктов в анализируемых средах показал, что максимальное накапливание этанола происходит в гидролизатах клубней аргентинского топинамбура и превосходит аналогичные характеристики в других средах в 3,5-6 раз.
— Было проведено исследование экспериментальных образцов штаммов микроорганимов-продуцентов молочной кислоты в новых гидролизных средах. Показано, что степень конверсии глюкозы в молочную кислоту максимальна в случае использования аргентинского топинамбура в качестве субстрата.
— Были изучены характеристики исходного растительного сырья. Для этого был проведен анализ инулина в клубнях топинамбура в соответствии с планом-графиком уборки культуры в Липецкой области. Было показано, что доля фруктоолигосахаридов с высокой степенью полимеризации свойственна клубня, собранным в конце сентября. Затем происходит рост содержания олигосахаридов с низкой степенью полимеризации и сахарозы.
— Были разработаны 3 лабораторных регламента (ЛТР), а именно: ЛТР получения ферментных препаратов с повышенной гидролитической особенностью по отношению к предобработанной возобновляемой биомассе, ЛТР получения фумаровой кислоты и ЛТР получения молочной кислоты.

V

— Проведено исследование продуктов после предобработки растительного сырья, в т.ч. состава простых сахаров, олиго- и полисахаридов, органических кислот и других компонентов в зависимости от источника растительного сырья. В качестве образцов выбраны стебли и клубни топинамбура в условиях различной хранимости, собранные в период с сентября по ноябрь. Показано, что лучше хранение переносят клубни, собранные в конце сентября, т.к. в них меньше сахарозы и больше инулоолигосахаридов высокой степени полимеризации. Кроме того, в них выше содержание сухих веществ.
— Проведены поиск и изучение ингибиторов процессов биоконверсии растительного сырья и разработаны условия предобработки, направленные на минимизацию их негативного влияния на выход целевого продукта. Изучены возможности разделения С5- и С6- сахаров в процессах предобработки стебле топинамбура. Определено негативное влияние ацетат-ионов на процесс конверсии сахаров в органические кислоты.
— Разработаны и оптимизированы комплексы карбогидраз для использования в процессе ферментативной конверсии растительных полисахаридов в простые сахара. Исследованы особенности синергетических взаимодействий ферментов в составе карбогидразного комплекса. Было показано, что в случае использования смеси компонентов целлюлаз ЦБГI и ЭГII, взятых в соотношении (3,75+1,25 мг/г) с дополнительным содержанием экзоинулиназы (3 мг/г сухого субстрата) наблюдали 62,5 г/л ВС, что на 25% выше результата осахаривания стеблей только экзоинулиназой и на 48% выше по сравнению с выходом сахаров при гидролизе только ферментными препаратами целлюлаз.
— Исследовано влияние растительных полифенольных соединений на эффективность карбогидраз. Изучена адсорбционная способность карбогидраз на лигнине.
— Разработан и оптимизирован процесс культивирования штаммов-продуцентов кар-богидраз. Изучение влияния состава сред и условий проведения ферментаций на биосинтез целевых ферментов. Показано, что снижение микрокристаллической целлюлозы в стартовой среде культивирования приводит к существенному снижению затрат при получении целевого ферментативного комплекса.
— Исследованы и оптимизированы постферментационные процессы, в т.ч. процессы отделения культуральной жидкости от биомассы, процессы концентрирования культуральной жидкости и ее стабилизации.
— Наработаны экспериментальные образцы ферментных препаратов INU13 и INU18, полученные на основе рекомбинантных штаммов, и проведены их испытания в соответствии с Программами и методиками их испытаний, разработанными ранее.
— Внесены корректировки в лабораторный регламент получения ферментных препаратов INU13 и INU18 с учетом новых данных. В частности, изменена стадия ионообменной очистки гидролизата клубней, а также произведена замена дрожжевого экстракта на соевую муку.

V

По окончании пятого этапа выполнения работ по Соглашению о субсидии №14.607.21.0050 от 25 августа 2014 г. были достигнуты следующие результаты:

  • Исследованы продукты реакции ферментного гидролиза предобработанного растительного сырья, клубней топинамбура. Показано, что продукты ферментативного гидролиза представлены в основном фруктозой и глюкозой. Получены данные о положительном влиянии иммобилизации свободных клеток гриба Rhizopus oryzae для процесса микробиологического синтеза фумаровой кислоты.
  • Разработан и оптимизирован процесс генерации и культивирования микроорганизмов, секретирующих карбоновые кислоты. Экспериментально установлено, что в случае выбора режима проведения процесса с подпитками субстратом не зависимо от концентрации сахаров в среде продуктивность процесса постепенно снижается на протяжении всего времени культивирования за счет накопления в среде целевого продукта и токсичных метаболитов, вызывающих ингибирование скорости процесса в целом. Однако, при периодическом режиме отмечается стабильная работа иммобилизованных биокатализаторов-продуцентов в ходе биоконверсии ферментолизатов растительного сырья в органические кислоты.
  • Разработан процесс выделения и очистки карбоновых кислот из культуральной среды. Установлено, что полученный в результате проведения анионообменной хроматографии раствор фумаровой кислоты далее целесообразно подкислить 0,1 М HCl и выдержать при 4оС в течение 24-28 ч, а затем отфильтровать.
  • Разработана Лабораторная методика синтеза биополимера на основе фумаровой кислоты.
  • Проведены работы по моделированию всего процесса биоконверсии растительного сырья в карбоновые кислоты. В результате проведенных исследований можно сделать вывод о том, что  разработанный процесс биоконверсии ферментолизатов растительного сырья в ФК следует проводить в биореакторе в следующих условиях: концентрация ВС 80±10 г/л, в том числе 15±5 г/л глюкозы, концентрация биокатализатора – 300 г/л, соотношение объемов жидкой фазы к газовой 1:2, рН – без внесения нейтрализующих агентов. При периодическом режиме ведения процесса длительность 1 цикла – 72ч.
  • Разработан проект технического задания на проведение ОТР по теме: «Биоконверсия некрахмального растительного сырья в органические (окси- и дикарбоновые) кислоты».
  • Проведена технико-экономической оценка результатов проекта.


Проект: Новые экспрессионные системы для высокопродуктивной гетерологичной экспрессии бактериальных экзо-ферментов, востребованных промышленной биотехнологией
Номер проекта: 14.616.21.0002
Мероприятие ФЦП: 2.2
Руководитель работ: Синицын Аркадий Пантелеймонович
Сроки выполнения: 2014–2016 гг.
Общий объем бюджетного и привлеченного финансирования: 44 млн. руб.

V

Объектом разработки является эукариотическая система экспрессии, позволяющая получить экспрессию бактериальных генов в низших грибах рода Aspergillus и Penicillium. Новизна разработки состоит в попытке экспрессии уникальных термофильных целлюлаз, являющихся компонентами целлюлосомы грам-положительной бактерии Clostridia termocellum в разработанной и высокопродуктивной экспрессионной системе низших грибов.
Таким образом, целью проекта является создание новых продуктивных рекомбинантных штаммов микроорганизмов, продуцирующих технические ферменты-бактериальные целлюлазы, обладающие уникальными свойствами при гидролизе целлюлозосодержащего сырья (ЦСС) при совместном участии российских и немецких партнеров.

V

— Проведен аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, относящейся к теме экспрессии гетерологичных генов в эукариотических системах. Проведено сравнение систем, рассмотрены преимущества и недостатки для каждой системы экспрессии. Показано, что экспрессия гетерологичных генов в низших грибах является перспективной задачей, способной решить ряд проблем промышленной биотехнологии.
— Проведен выбор оптимальных реципиентных штаммов низших грибов по следующим критериям: продуктивность, стабильность продукции белков, низкий уровень экспрессии протеаз. К таким штаммам относятся, в том числе, и штаммы Aspergillus awamori и Penicillium canescens.
— Проведен биоинформатический анализ частоты использования кодонов в выбранных штаммах Penicillium и Aspergillus для моделирования синтетических бактериальных генов cel1 и cel2 из Clostridium thermocellum. Подготовлена таблица частоты использования кодонов в выбранных штаммах для передачи данной информации немецким партнерам.
— Проведены патентные исследований в соответствии с ГОСТ 15.011-96. Показано, что оба объекта патентных исследований «Штамм мицелиального гриба Penicillium canescens как основа для получения ферментных препаратов целлюлаз бактериального происхождения» и «Штамм мицелиального гриба Aspergillus awamori как основа для получения ферментных препаратов целлюлаз бактериального происхождения» могут являться базовыми штаммами для использования их в гетерологичной экспрессии бактериальных целлюлаз

V

— Клонированы синтезированные гены клостридиальных целлюлаз в интеграционный вектор для экспрессии в низших грибах родов Aspergillus и Penicillium.
— Проведена трансформация ДНК-конструкций в реципиентные штаммы Penicillium и Aspergillus. Проведен селективный отбор трансформантов.
— Проведено тестирование положительных трансформантов на вставку гетерологичных генов бактериальных целлюлаз в хромосому грибов рода Aspergillus и Penicillium.
— Проведено тестирование продукции целлюлаз по отработанной методике высокопродуктивного скрининга в плашках.
— Отобраны по 3 наилучших рекомбинантных штамма для каждого клонированного гена клостридиальной целлюлазы по критерию наличия детектируемого гетерологичного белка.
— Проведено культивирование отобранных рекомбинантных штаммов в колбах, в малых объемах (100 мл). Приготовлены жидкие формы ферментных препаратов с использованием микрофильтрации и концентрирования.
Со стороны иностранных партнеров все работы выполнены в запланированном объеме и достигнуты следующие результаты:
— Синтезированы 2-а гена термофильных клостридиальных целлюлаз с оптимизированной структурой и переданы в ИНБИ РАН для клонирования в интеграционные вектора (работа 1.2 1-ого Этапа).
— Разработан подходящий интеграционный вектор для экспрессии в Bacillus — подобран промотор, оператор и лидирующий пептид для индуцибельной высокоэффективной бактериальной экспрессии. Проведено тестирование выбранной системы с маркерным геном (работа 1.5 1-ого Этапа).
— Клонированы новые синтезированные гены целлюлаз с оптимизированной структурой в подобранный бактериальный вектор для экспрессии в бактериях рода Bacillus.
— Проведена трансформация ДНК-конструкций в штамм-реципиент Bacillus и выбраны штаммы с множественной интеграцией в хромосому.
— Проведен первый раунд скрининга: выбраны наилучшие трансформанты с высоким уровнем продукции целевого белка в культуральных плашках.

V

— Культивированы отобранные рекомбинантные штаммы грибов рода Penicillium и Aspergillus в 1-л ферментерах на стандартной среде культивирования. В качестве контроля выбран штамм-реципент Penicillium canescens RN3-11-7. За экспрессией гетерологичных белков CELL, CELS, CELR и CELT следили электрофоретически.
— Проведен анализ биосинтеза бактериальных целлюлаз в течение ферментации. Показано, что собственная протеолитическая активность штамма не влияет на струкуру и функцию собственных секретируемых белков, однако, является критической для гетерологичных клостридиальных целлюлаз в особенности CELL и CELT. Показано, что использование ионов Ca2+ в качестве добавки к стандартной среде культивирования, содержащей соеву шелуху, кукурузный экстракт и отруби, стабилизирует экспрессию белков CELS и CELR и приводит к получению 50% недеградируемого бека в секретируемой жидкости рекомбинантных штаммов.
— Были подобраны условия стабилизации жидких форм ферментных препаратов клостридиальных целлюлаз, представляющие собой ультраконцентрированные культуральные жидкости, собранные после 6-ти дней культивирования ркомбинантных грибов.
— Тестирование секреции клостридиальных целлюлаз в грибных штаммах в течение 5 пассажей показало наличие гетерологичной полосы у рекомбинантных штаммов-продуцентов белков CELS и CELR. Интенсивность полосы, соответствующей гетерологичному белку оставалась неизменной. Результаты MALDI-TOF спектрометрии показали соответствие полосы целлюлаз искомым клостридиальным целлюлазам.
— Были проведены дополнительные патентные исследования для определения новизны и уровня техники изобретения «Новый рекомбинантный штамм мицелиального гриба Penicillium canescens CS15, продуцирующий целлюлазу Clostridium thermocellum, и способ его культивирования». Исследования показали, что технический результат, получаемый при реализации разработанных технических решенийбудет являться новым и даст возможность эффективной продукции целлюлазы из  Clostridium thermocellum в гетерологичном хозяине Penicillium canescens RN3-11-7.
V

— Проведены дополнительные патентные исследования с целью определения патентоспособности промежуточных результатов ПНИ. Показано, что рекомбинантный штамм Penicillium canescens CL14, продуцент клостридиальной целлюлазы Cel5L обладает признаками новизны и рекомендован к патентованию. Штамм депонирован в Всероссийскую коллекцию микроорганизмов.
— Оптимизированы условия получения сухих форм ферментных препаратов для четырех штаммов- продуцентов бактериальных целлюлаз CELS, CELR, CELL и CELT. Показано, что необходимым компонентом культивирования соответствующих рекомбинантных штаммов является хлорид кальция в концентрации 10 мМ. Схема подачи хлорида кальция – дробная. Также рекомендовано добавление пепстатина в количестве 3*10-5М в качестве ингибитора собственных протеаз штамма Penicillium canescens.
— Получены экспериментальные образцs сухих форм ферментных препаратов клост- ридиальных целлюлаз CELS, CELR, CELL и CELT. А также их аналогов с 6*His-Taq на С-конце.
— Используя афинную хроматографию, выделены и очищены индивидуальные рекомбинантные целлюлазы CELS и СELR из сухих ферментных препаратов, полученных на основе рекомбинантных штаммов низших грибов Penicillium. Описаны их свойства, в частности, субстратная специфичность. Принадлежность белка в смываемых фракциях к CELS или CELR доказана с использованием MALDI-TOF анализа.
— Разработан лабораторный регламента получения ферментных препаратов бактериаль- ных целлюлаз в эукариотических системах экспрессии на примере получения CEL5L клостридиальной целлюлазы.
— Определены возможности эффективного связывания очищенных рекомбинантных бактериальных целлюлаз с другими компонентами клостридиальной целлюлосомы in vitro, в частности, со скаффолд –белком cipA. Показано, что, вероятнее всего, связывание cipA белка происходит только с С-концом бактериальных целлюлаз. Предложены варианты решения данной проблемы методами белковой инженерии бактериальных целлюлаз.
V

По окончании пятого этапа выполнения работ по Соглашению о субсидии №14.616.21.0002 от 09 сентября 2014 г. были достигнуты следующие результаты:

  • Проведено тестирование отобранных рекомбинантных штаммов Penicillium и Aspergillus, продуцирующих клостридиальные целлюлазы CelL, СelS, CelR и CelT в лабораторных ферментерах, объемом 10 л.  Основными параметрами тестирования являлись стабильность секреции целевых целлюлаз, а также вязкость ферментационной среды. Также показано, что добавление ионов Са2+ в концентрации 10 мМ оказывает стабилизирующее действие на секрецию гетерологичных белков.
  • Подобраны производственные параметры ферментационного процесса, такие как тип инокуляции, условия индукции, скорость аэрации. Показано, что при переходе от 1-л к 10-л объемам культивирования сохраняется линейность параметров.
  • Проведена технико-экономическая оценка результатов проекта. Показано, что при экспрессии гетерологичных белков на уровне 15% от общего пула секретируемых белков, процесс культивирования целлюлосомальных белков  становится экономически оправданным в случае экспрессии их в мицелиальном грибе Penicillium canescens.
  • На основе полученных в проекте данных разработан проект технического задания на проведение ОТР по теме: «Экспрессионные системы для высокопродуктивной гетерологичной экспрессии бактериальных экзоферментов, востребованных промышленной биотехнологией».


Проект: Разработка биотехнологических средств комплексного контроля пищевых продуктов и кормов на контаминацию микотоксинами
Номер проекта: 14.607.21.0015
Мероприятие ФЦП: 1.3
Руководитель работ: Дзантиев Борис Борисович
Сроки выполнения: 2014-2016 гг.
Общий объем бюджетного и привлеченного финансирования: 60 млн. руб.

V

Проект направлен на разработку и испытание новых биоаналитических систем для контроля токсичных веществ в сельскохозяйственной продукции и продуктах питания. В ходе выполнения проекта будут разработаны и изготовлены экспериментальные образцы иммунохимических тест-систем определения приоритетных микотоксинов – афлатоксина В1, дезоксиниваленола (вомитоксина), зеараленона, фумонизина, Т-2 токсина, охратоксина А в пшенице, ячмене, кукурузе, а также в продуктах их переработки.

Высокая востребованность тест-систем для контроля микотоксинов определяется их ключевой ролью для оценки качества сельскохозяйственных культур. Объемы международной торговли такой продукцией, как пшеница, рис, ячмень, кукуруза, соя и масличные культуры, составляют сотни миллионов тонн в год. В зависимости от уровня содержания микотоксинов определяется сортность пшеницы, что может оказать радикальное влияние на экспортный потенциал отечественной продукции. Исходя из этого, своевременный и тщательный контроль содержания микотоксинов как в готовой продукции, так и на всех стадиях ее производства является неотъемлемой и важной частью повышения экономического благосостояния страны.

Выполняемый проект непосредственно направлен на создание и характеристику прототипных образцов иммуноаналитических систем, которые рассматриваются как объекты последующих опытно-конструкторских работ. Работы по проекту включают изготовление и апробацию экспериментальных образцов тест-систем, а также подготовку документации для масштабируемых технологий производства тест-систем.

V

Проведен скрининг антител для каждого из 6 целевых антигенов — от 3 до 10 клонов, полученных из разных источников. Проведена оценка их параметров – кинетических и термодинамических констант связывания с использованием безмаркерной биосенсорной системы на основе поверхностного резонанса, и рабочей концентрации и рабочего диапазона в классической микропланшетной ИФА системе.

Пределы обнаружения антигенов в данной тест-системе варьировали в диапазоне 20 пг/мл – 2 нг/мл в зависимости от определяемого соединения. Указанные пределы обнаружения микотоксинов согласуются с аналитическими характеристиками ИФА и ИХА в соответствии нормативными требованиями к уровню контаминации микотоксинами. На основе полученного массива данных отобраны антитела для дальнейшей работы.

Проведен скрининг ряда коммерческих и синтезированных в рамках проекта конъюгатов микотоксинов с белком носителем или ферментной меткой (3-7 соединений на каждый из 6 микотоксинов).

Полученные конъюгаты испытывались как в ИФА/ИХА системах, так и в решениях на основе поверхностного плазмонного резонанса, что дает возможность получить количественные оценки иммуноспецифического взаимодействия. На основании экспериментальных данных по амплитудам сигнала и константам связывания отобраны конъюгаты, обладающие наибольшей потенциальной эффективностью в ИХА и ИФА.

Получены наноразмерные носители для иммуноферментного и иммунохроматографического анализа. Препараты охарактеризованы методами просвечивающей электронной микроскопии и динамического светорассеяния. Результаты показали высокую степень гомогенности размеров синтезированных препаратов. Получены конъюгаты с антителами и проведена их характеристика методами иммуноферментного анализа и атомно-силовой микроскопии. Показана стабильность препарата магнитных наночастиц со средним диаметром 10 нм и золотых со средним диаметром 25-30 нм, конъюгированного с антителами. 

V

В ходе выполнения проекта по Соглашению от 5 июня 2014 г. № 14.607.21.0015, дополнительное соглашение от 13 мая 2015 г. №1 с Минобрнауки России в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» на этапе № 2 в период с 1 января 2015 г. по 30 июня 2015 г. выполнялись следующие работы:
1. Исследование степени сохранения оптических и магнитных свойств наноразмерных носителей при разных режимах получения межмолекулярных конъюгатов.
2. Исследование степени сохранения иммунохимических свойств иммунореагентов при разных режимах получения межмолекулярных конъюгатов с наноразмерными носителями; выбор реагентов, которые в ходе анализа обеспечивают формирование детектируемых соединений или межмолекулярных комплексов.
3. Обоснование оптимальной комплектации тест-систем, включая требования к антигенам, антителам, наноразмерным носителям, мембранным носителям, маркерам, детектирующей технике.
4. Разработка требований к методам пробоотбора.
5. Разработка требований к методам пробоподготовки. Оценка полноты экстракции микотоксинов из биопроб.
6. Разработка требований к выборкам биоматериала для апробации тест-систем. Формирование репрезентативных выборок растительных биопроб для характеристики тест-систем.
7. Подготовка и оснащение производственных помещений.

Получены следующие основные результаты:
Проведена оценка сохранения свойств наномаркеров при разных режимах получения конъюгатов. Для золотых наночастиц, конъюгируемых с антителами, показано отсутствие агрегационных процессов; при этом наблюдается сдвиг среднего диаметра на 15 нм, отражающий изменения структуры поверхности. Для магнитных частиц показано сохранение как структуры, так и магнитных свойств агрегатов. Синтезированные конъюгаты охарактеризованы по степени сохранения специфических свойств антител, входящих в их состав. Выбраны соотношения компонентов в составе конъюгатов, обеспечивающие наибольшую интенсивность аналитического сигнала при минимальном расходовании иммуноглобулинов – 10-15 мг антител на мл коллоидной суспензии.
Предложены оптимальные комплектации иммуноферментных и иммунохроматографических тест-систем для определения микотоксинов, обеспечивающие простоту выполнения анализа, минимизацию дополнительного оборудования и реагентов и снижающие себестоимость тест-систем.
Разработаны требования к методам пробоотбора, учитывающие гетерогенность анализируемого субстрата и неравномерность распределения контаминированных участков. Установлены схемы забора проб и требования к их объему, позволяющие получить объективную картину контаминации партии продукции в целом.
Проведена разработка требований к методам пробоподготовки, включающих процедуры измельчения, перемешивания, экстракции и очистки анализируемых проб растительного сырья. Проведена экспериментальная оценка степени экстракции при использовании различных водно-органических смесей. Показана эффективность использования смеси метанол:вода (70:30) для экстракции афлатоксина В1, охратоксина А, зеараленона и Т-2 токсина.
Полученные характеристики компонентов тест-систем подтверждают потенциальную возможность создания средств высокочувствительного иммуноанализа для детекции микотоксинов в сельскохозяйственной продукции.
На средства индустриального партнера, ООО «Русхимбио», проведены предусмотренные проектом работы по подготовке разрабатываемого продукта к конечной характеристике и коммерциализации. На основании приоритетных объектов контаминации (основных поражаемых сельскохозяйственных культур) для каждого микотоксина разработаны требования к выборкам анализируемых биопроб для испытаний тест-систем. Сформированы репрезентативные выборки для апробации разрабатываемых средств детекции микотоксинов. Производственные помещения для выпуска тест-систем, разрабатываемых в рамках проекта, оснащены общетехнологическим оборудованием, включающим системы кондиционирования и очистки воздуха. Проведена подготовка зоны производства иммунохроматографических тест-систем, в т.ч. оборудования для контроля и поддержания влажности помещений ниже 30%, установка производственного оборудования для очистки и отвода воды.
При реализации проекта применены новые научные (технологические) решения, такие как непрямое одностадийное введение маркера и использование контроля скорости потока на основе внесения дополнительных мембран с сывороточным альбумином. Комбинация данных решений позволит создать продукты с аналитическими характеристиками, не уступающими мировым решениям.
Обязательства получателя субсидии исполнены надлежащем образом и в полном объеме.

V

В ходе выполнения проекта по Соглашению от 5 июня 2014 г. № 14.607.21.0015, дополнительные соглашения от 13 мая 2015 г. №1, от 08 сентября 2015 г. №2 с Минобрнауки России в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» на этапе № 3 в период с 1 июля 2015 г. по 31 декабря 2015 г. выполнялись следующие работы:
1. Разработка протоколов проведения анализа с использованием полученных реагентов

—  для экспрессного внелабораторного иммунохроматографического контроля с мультипараметрической детекцией;

— для высокочувствительного лабораторного иммуноферментного контроля;

— для экспрессного внелабораторного иммуноферментного контроля с визуальной детекцией.

2. Получение и характеристика градуировочных кривых для оценки содержания микотоксинов в биопробах; оценка влияния компонентов тест-систем на время анализа, предел обнаружения и рабочий диапазон тест-систем .

3. Разработка методик изготовления экспериментальных образцов тест-систем.

4. Исследование требований к комплектациям тест-систем, обеспечивающим достижение оптимальных функциональных характеристик; подготовка рекомендаций по выбору оптимальных комплектаций  тест-систем.

5. Изготовление экспериментальных образцов  тест-систем.

6. Сравнительная характеристика экспериментальных образцов  тест-систем; характеристика иммунохимических реакций, происходящих в разрабатываемых тест-системах; определение концентрационных и кинетических закономерностей взаимодействий в ходе анализа.

7. Подготовка и подача заявки для защиты интеллектуальной собственности на результаты ПНИ, относящейся к методике проведения экспрессного иммуноанализа.

8. Оборудование технологической линии для производства иммуноферментных тест-систем.
9. Апробация оборудования для количественной регистрации результатов измерений.

10. Проведение мероприятий по освещению и популяризации разработок.

Получены следующие основные результаты:

Разработаны протоколы проведения иммунохроматографического, экспрессного иммуноферментного и иммуноферментного анализа с хемилюминесцентной детекцией с использованием полученных ранее реагентов. Проведено исследование требований к комплектациям тест-систем, обеспечивающим достижение оптимальных функциональных характеристик. Определены концентрационные и кинетические закономерности иммунных взаимодействий, происходящих в ходе всех трех видов анализа. Подготовлены рекомендации по выбору оптимальных компонентов тест-систем. Проведены необходимые оптимизации основных концентраций реагентов, обеспечивающих достижение заявленных результатов.

Получены и охарактеризованы градуировочные кривые определения афлатоксина В1, охратоксина А. зеараленона, Т-2 токсина, фумонизина В1 и ДОНа. С использованием полученных градуировочных кривых проведена оценка содержания микотоксинов в биопробах – экстрактах сельскохозяйственных культур. Проанализировано влияние основных компонентов тест-систем на время анализа, предел обнаружения и рабочий диапазон детектируемых концентраций микотоксинов.

Подготовлены и поданы две заявки на патенты РФ на изобретения: «Способ проведения иммунохроматографического анализа с высокой степенью выявления маркера» (заявка № 2015156958 от 30.12.2015) и «Способ проведения высокочувствительного иммунохроматографического анализа с прединкубацией иммунореагента и пробы и усилением детектируемого окрашивания» (заявка № 2015156960 от 30.12.2015).

Разработаны методики изготовления экспериментальных образцов тест-систем с указанием необходимых реагентов, длительности всех стадий изготовления, концентраций реагентов. Изготовлены экспериментальные образцы тест-систем для проведения дальнейших испытаний.

На средства индустриального партнера, ООО «Русхимбио», проведены предусмотренные проектом работы по оборудованию технологической линии для производства иммуноферментных тест-систем. Проведена апробация для количественной регистрации результатов измерений, а также мероприятия по освещению и популяризации разработок.

Предусмотренные календарным планом работы выполнены в полном объеме. Полученные результаты свидетельствуют об успешности выполнения третьего этапа и создают предпосылки для успешной реализации проекта в целом.

Состав выполненных работ удовлетворяет условиям Соглашения о предоставлении субсидии, в том числе Техническому заданию и Плану-графику исполнения обязательств. Результаты выполненных работ соответствует требованиям Технического задания и нормативной документации. Содержание отчётной документации соответствует условиям Соглашения о предоставлении субсидии, в том числе Техническому заданию и Плану-графику исполнения обязательств.

Обязательства получателя субсидии исполнены надлежащем образом и в полном объеме.

V

В ходе выполнения проекта по Соглашению от 5 июня 2014 г. № 14.607.21.0015, дополнительные соглашения от 13 мая 2015 г. №1, от 08 сентября 2015 г. №2 с Минобрнауки России в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» на этапе № 4 в период с 1 января 2016 г. по 30 июня 2016 г. выполнялись следующие работы:

1. Разработка рекомендаций по документированию результатов анализа с использованием разработанных тест-систем.

2. Разработка программы и методик исследовательских испытаний экспериментальных образцов тест-систем.

3. Разработка и обоснование требований к репрезентативной выборке биопроб для проведения исследовательских испытаний экспериментальных образцов тест-систем.

4. Проведение исследовательских испытаний экспериментальных образцов тест-систем и статистическая обработка результатов испытаний.

5. Определение пределов обнаружения микотоксинов, рабочих диапазонов, количественная характеристика воспроизводимости результатов анализов с использованием экспериментальных образцов разработанных тест-систем.

6. Апробация экспериментальных образцов тест-систем для анализа растительного материала.

7. Сравнительная характеристика разработанных тест-систем и других видов иммунохимического анализа микотоксинов.

8. Подготовка методических рекомендаций по применению тест-систем.
Получены следующие основные результаты:

В ходе выполнения данного этапа проекта были подготовлены и разработаны рекомендации по документированию результатов анализа, проводимого с использованием созданных иммуноаналитических тест-систем, разработаны Программы и методики исследовательских испытаний экспериментальных образцов тест-систем.

Была проведена разработка и обоснование требований к репрезентативной выборке биопроб для проведения исследовательских испытаний экспериментальных образцов тест-систем. На основе полученных данных было выполнено определение пределов обнаружения микотоксинов, рабочих диапазонов, представлена полная количественная характеристика воспроизводимости с использованием экспериментальных образцов разработанных тест-систем.

Была проведена апробация экспериментальных тест-систем, внесены корректировки по ее результатам и проведены повторные испытания. Разработаны методические рекомендации по применению создаваемых тест-систем.

На средства индустриального партнера ООО «Русхимбио» проведены предусмотренные проектом работы по апробации оборудования, входящего в цепочку производства иммуноферментных тест-систем, проведено оборудование технологической линии для производства иммунохроматографических тест-систем. Подготовлены проекты инструкций, технических условий и лабораторных регламентов изготовления тест-систем. Проведены мероприятия по освещению и популяризации разработок, разработан бизнес-план производства создаваемых тест-систем.

Предусмотренные календарным планом работы выполнены в полном объеме. Полученные результаты свидетельствуют об успешности выполнения четвертого этапа и дают предпосылки к успешной реализации проекта.

V

В ходе выполнения проекта по Соглашению от 5 июня 2014 г. № 14.607.21.0015, дополнительные соглашения от 13 мая 2015 г. №1, от 08 сентября 2015 г. №2 с Минобрнауки России в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» на этапе № 5 в период с 1 июля 2016 г. по 31 декабря 2016 г. выполнялись следующие работы:

  1. Разработка рекомендаций по разработке тест-систем для детекции микотоксинов, обеспечивающих применение предложенных в рамках проекта методических решений для анализа новых объектов.
  2. Подготовка и подача заявки для защиты интеллектуальной собственности на результаты пни.
  3. Подготовка проекта технического задания на проведение ОТР по теме «создание технологии производства биотехнологических средств комплексного контроля микотоксиновой контаминации зерновой сельскохозяйственной продукции и продуктов ее переработки».
  4. Оценка полноты решения задач и эффективности полученных результатов в сравнении с современным научно-техническим уровнем.
  5. Разработка рекомендаций по практическому применению результатов пни, в том числе, созданных объектов интеллектуальной собственности.

Получены следующие основные результаты:
В ходе выполнения данного этапа разработаны рекомендации по созданию тест-систем, обеспечивающих применение предложенных в рамках проекта методических решений для анализа новых объектов.

Подготовлена и подана заявка для защиты интеллектуальной собственности на результаты ПНИ, описывающая новый метод цветовой дифференциации контрольной и аналитической зон за счет использования наночастиц золота разного цвета.

Подготовлен проект технического задания на проведение ОТР по теме «Создание технологии производства биотехнологических средств комплексного контроля микотоксиновой контаминации зерновой сельскохозяйственной продукции и продуктов ее переработки».

Проведена оценка полноты решения задач и эффективности полученных результатов в сравнении с современным научно-техническим уровнем. Положительно оценены созданные в ходе выполнения проекта иммунохимические системы определения практически значимых микотоксинов – афлатоксина B1, дезоксинива-ленола, зеараленона, фумонизина B1, T-2 токсина, охратоксина A. Показано, что они соответствуют современному научно-техническому уровню, а в некоторых своих аспектах превосходят его.

Разработаны рекомендации по практическому применению результатов ПНИ, в том числе созданных объектов интеллектуальной собственности.

На средства индустриального партнера ООО «Русхимбио» проведен комплекс работ, предусмотренных календарным планом на данном этапе проекта. Проведены мероприятия по освещению и полпуляризации разработок. Проведены предусмотренные проектом работы по апробации оборудования, входящего в цепочку производства иммунохроматографических тест-систем. Разработаны проекты методик контроля качества при масштабируемом производстве тест-систем. Подготовлены проекты технических условий на производство тест-систем. Разработана маркетинговая стратегии продаж тест-систем. Проведены испытания тест-систем с участием потенциальных конечных пользователей, продающих и реализующих компаний. Получены положительные отзывы на созданную продукцию. Проведены мероприятия по информационной поддержке планируемой коммерческой реализации тест-систем. Проведена технико-экономическая оценка рыночного потенциала полученных результатов.

Полученные результаты свидетельствуют об успешности выполнения проекта и дают предпосылки к успешной коммерциализации созданных продуктов.


Проект: Разработка новых методов иммунохимического контроля ветеринарных препаратов, их производных и метаболитов с регулируемой специфичностью для мониторинга качества и безопасности продуктов питания
Номер проекта: 14.613.21.0028
Мероприятие ФЦП: 2.1
Руководитель работ: Дзантиев Борис Борисович
Сроки выполнения: 2014-2015 гг.
Общий объем бюджетного и привлеченного финансирования: 31,6 млн. руб.

V

Целью настоящего проекта является разработка новых методов иммунохимического контроля ветеринарных препаратов,их производных и метаболитов с регулируемой специфичностью для мониторинга качества и безопасности продуктов питания,а также развитие международного (российско-китайского) сотрудничества в области биоаналитических технологий. Разработка в результате выполнения проекта новых методик контроля токсичных контаминант обеспечит возможность эффективного мониторингасельскохозяйственной и пищевой продукции, повышения ее качества и безопасности. Работы по проекту включают выбор методических решений, обеспечивающих возможность дальнейшего масштабируемого изготовленияи внедрения в практику новых тест-систем, основанных на предлагаемых подходах.Разработка в результате выполнения проекта новых методик контроля токсичных контаминант обеспечит возможность эффективного мониторинга сельскохозяйственной и пищевой продукции, повышения ее качества и безопасности. Работы по проекту включают выбор методических решений, обеспечивающих возможность дальнейшего масштабируемого изготовления и внедрения в практику новых тест-систем, основанных на предлагаемых подходах.Характеризуемые в рамках проекта антибиотики входят в число приоритетных контролируемых токсичных контаминант сельскохозяйственной и пищевой продукции. Разработка новых, более производительных и достоверных методик контроля их содержания, в том числе во внелабораторных условиях, и внедрение в практику тест-систем на их основе обеспечит возможность широкого мониторинга контаминации, предотвращения рисков для потребителей и в конечном счете – защиту здоровья и безопасности населения.Разрабатываемые изделия будут предназначены для использования в лабораторной диагностике – в работе служб агротехнического и ветеринарного контроля, санитарно-эпидемического контроля, в системе Роспотребнадзора, в производственных лабораториях предприятий пищевой промышленности. Внедрение изделий в практику обеспечит оперативное выявление контаминации и своевременное принятие мер, направленных на защиту здоровья потребителей. При этом аналитические характеристики разработанных тест-систем обеспечат высокую конкурентоспособность и дадут возможность продвижения продукции на новые площадки и сферы рынка. В результате выполнения проекта будут решены технологические вопросы прототипирования производства трех видов тест-систем и разработаны документы для перехода к стадии ОКР. Подготовленная документация будет передана индустриальным партнерам исполнителя проекта, с которыми ИНБИ РАН успешно взаимодействует при внедрении в практику других иммуноаналитических разработок. 

V

В рамках первого этапа проекта проведен анализ литературных источников по получению антител с групповой специфичностью к антибиотикам бета-лактамного ряда и пенициллинам. Проведены патентные исследования по методам иммунохимического анализа, характеризующиеся широкой специфичностью по отношению к ветеринарным препаратам. На основе нормативных актов проведена сравнительная оценка предельно допустимых концентраций, которые необходимо детектировать с помощью разрабатываемых тест-систем.

Построены пространственные структуры приоритетных бета-лактамов и фторхинолонов. Их сравнительная оценка позволила определить сходные функциональные группы и составить структурную модель сайтов распознавания для групп-специфических антител. Выбраны методы оценки структурно-функциональных корреляций на основе метода QSAR при разработке индивидуальных и класс-специфических методик иммуноанализа. Составлена панель реагентов для иммуноанализа на основании коммерчески доступных препаратов, реагентов, ранее полученных российскими и китайскими участниками проекта. Изучены антиген-связывающие свойства используемых в работе антител. Получены конъюгаты исследуемых антибиотиков с белками-носителями разной природы, конъюгаты маркеров (флуоресцеин, пероксидаза хрена и коллоидное золото) со специфическими антителами, которые будут использованы для разработки тест-систем. Комплексы антител с нанодисперсными носителями охарактеризованы с помощью таких методов, как просвечивающая электронная микроскопия, атомно-силовая микроскопия, анализ результатов видеоцифровой регистрации иммунохимических взаимодействий в проточных системах.

Осуществлено измерение кинетических и равновесных параметров реакции как в микропланшетной иммуноферментной системе, так и с использованием биосенсорной системы Biacore. Для измерения равновесных и кинетических констант иммунохимической реакции применены подходы, основанные на анализе зависимости связывания антител с иммобилизованным антигеном от концентрации антигена в растворе в условиях, когда количество образующихся на носителе комплексов пренебрежимо мало и не вызывает сдвига равновесия в растворе. Полученные результаты обеспечивают формирование необходимой реагентной базы для выполнения последующих задач проекта.

V

В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от 28 ноября 2014 г. № 14.613.21.0028 с Минобрнауки России в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» на этапе № 2 в период с 1 января 2015 г. по 30 июня 2015 г. выполнялись следующие работы:
1. Сравнительная оценка особенностей кинетического гетерогенного (иммунохроматографического), равновесного гетерогенного (иммуноферментного) и гомогенного (поляризационного флуоресцентного) иммуноанализа по отношению к характеристикам перекрестной реактивности структурно близких соединений.
2. Сравнительная характеристика вклада различных структурных элементов определяемых соединений в процесс иммунного распознавания.
3. Разработка дополнительных методических решений по модуляции специфичности, предела обнаружения и рабочего диапазона иммуноанализа.
4. Разработка методик проведения индивидуального и класс-специфического иммуноопределения ветеринарных препаратов различных химических классов.
5. Проведение дополнительных патентных исследований. Подготовка и подача заявки для защиты интеллектуальной собственности на методические решения, предложенные при разработке иммунохимических методик детекции ветеринарных препаратов.
6. Изготовление экспериментальных образцов тест-систем для проведения иммунохроматографического, иммуноферментного и поляризационного флуоресцентного иммуноанализа ветеринарных препаратов в пищевых продуктах.
7. Разработка Программы и методик испытаний экспериментальных образцов тест-систем.
8. Формирование репрезентативной панели проб пищевых продуктов для валидации разработанных тест-систем с учетом приоритетных объектов при контроле пищевой безопасности в РФ и Китае.
9. Теоретический анализ требований, предъявляемых к методам контроля контаминант с регулируемой специфичностью.
10. Характеристика возможностей снижения предела обнаружения в хемилюминесцентном иммуноферментном анализе ветеринарных препаратов.
11. Наработка и скрининг иммунореагентов и определение режимов проведения иммунохимических взаимодействий в разрабатываемых тест-системах.
12. Определение метрологических характеристик разрабатываемых методик иммуноанализа ветеринарных препаратов.

Получены следующие основные результаты:
В рамках экспериментального сравнения трех разрабатываемых типов тест-систем показана возможность варьирования специфичности анализа. Показана возможность управления специфичностью анализа с помощью изменения структуры определяемого антибиотика. Предложены решения, позволяющие в 5-10 раз снизить предел детекции и в 2-5 раз расширить рабочий диапазон тест-систем. Подана заявка на патент. Созданы иммунохимические тест-системы для определения как индивидуальных антибиотиков фторхинолонового ряда, так и суммарного содержания препаратов одного класса; разработаны методики проведения анализа с помощью данных тест-систем. Для валидации разработанных систем сформирована панель проб пищевых продуктов, включающая образцы молока, молочных продуктов, мяса, яиц и меда. Оценка эффективности работы тест-систем будет проведена на основании разработанных Программы и методик испытаний. Иностранным партнером (Южно-Китайский Сельскохозяйственный Университет, г. Гуанчжоу, Китай) проведен теоретический анализ требований, предъявляемых к методам контроля соединений с регулируемой специфичностью, сравнение колориметрической и хемилюминесцентной детекции в иммуноферментном анализе. Партнерами получены новые иммунореагенты, позволяющие расширить специфичность разработанных тест-систем.
Полученные охраноспособные результаты интеллектуальной собственности: Подана заявка на патент РФ на изобретение № 2015125368 от 26.06.2015 «Способ экспрессного иммунохроматографического определения соединений в широком диапазоне концентраций».
В целом выполненные работы обеспечивают необходимый базис для решения задач заключительного этапа выполнения проекта и свидетельствуют о высокой степени функциональности специфических реагентов, отобранных для использования в аналитических системах. Разработанные методики и изготовленные образцы тест-систем позволяют получить полную оценку эффективности предложенных решений. Сформированная панель проб пищевых продуктов позволяет оценить эффективность работы тест-систем в РФ и Китае.
Полученные результаты соответствуют мировому уровню исследований в данной области. В отличие от зарубежных аналогов, разработанные тест-системы позволяют определять антибиотики в широком диапазоне концентраций.
Обязательства получателя субсидии исполнены надлежащем образом и в полном объеме.

V

В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от 28 ноября 2014 г. № 14.613.21.0028 с Минобрнауки России в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» на этапе № 3 в период с 1 июля 2015 г. по 31 декабря 2015 г. выполнялись следующие работы:
1. Сравнительное изучение протоколов пробоподготовки и пробоотбора при определении ветеринарных препаратов в различных пищевых продуктах, в том числе сравнение особенностей нормативных требований РФ и Китая.

2. Характеристика влияния матрикса тестируемых проб на результаты детекции ветеринарных препаратов разработанными методами иммуноанализа.

3. Проведение совместных испытаний экспериментальных образцов разработанных тест-систем с участием российской и китайской стороны.

4. Оценка достоверности получаемых результатов детекции ветеринарных препаратов в различных пищевых продуктах путем сравнения данных иммунохимического и хроматографического анализа.

5. Подготовка лабораторных регламентов изготовления разработанных тест-систем с учетом результатов совместных испытаний.

6. Информирование потенциальных производителей и конечных пользователей тест-систем в РФ и Китае.

7. Проверка эффективности средств прогнозирования специфичности иммуноаналитических тест-систем при перенесении разработанных подходов на другие объекты – контролируемые токсичные контаминанты пищевой продукции.

8. Оценка полноты решения поставленных задач. Подготовка рекомендаций по применению установленных закономерностей индивидуального и класс-специфического иммуноанализа и разработанных тест-систем для определения ветеринарных препаратов в пищевой продукции, в том числе – по разработке масштабируемых технологий производства тест-систем. Разработка плана использования результатов проекта, полученных совместно с иностранным партнером.

9, Определение критериев контроля качества иммунореагентов для использования в разрабатываемых тест-системах.

10. Изучение влияния компонентов реакционной среды на кинетику и специфичность иммунного взаимодействия при детекции ветеринарных препаратов с использованием разработанных методик иммуноанализа.

11. Участие китайского партнера в проведении совместных испытаний экспериментальных образцов разработанных тест-систем.

12. Характеристика методических решений, обеспечивающих полноту выявления целевых соединений в матриксах проб сложного состава.

13. Оценка конкурентного потенциала разработанных тест-систем.

Получены следующие основные результаты:
Проведено сравнительное изучение протоколов пробоподготовки и пробоотбора при определении ветеринарных препаратов в различных продуктах питания, проведено сравнение особенностей нормативных требований РФ и Китая. Охарактеризовано влияние матрикса анализируемых проб на аналитические характеристики разработанных тест-систем и на результаты анализа. В рамках двусторонних визитов российских и китайских участников проекта проведены совместные испытания экспериментальных образцов разработанных иммунохимических тест-систем. Достоверность получаемых результатов определения антибиотиков подтверждена путем сравнения с данными хроматографического анализа. Подготовлены лабораторные регламенты изготовления разработанных тест-систем с учетом результатов проведенных испытаний. Проведено информирование потенциальных производителей и конечных пользователей тест-систем в РФ и Китае. Показана эффективность средств прогнозирования специфичности иммуноаналитических тест-систем путем сравнения теоретических данных, полученных с помощью математических моделей QSAR, с экспериментальными данными для разработанных систем. Подготовлены рекомендации по применению установленных закономерностей индивидуального и класс-специфического иммуноанализа и разработанных систем. Разработан план использования результатов проекта, полученных совместно с иностранным партнером.

Иностранным партнером – Южно-Китайский сельскохозяйственный университет, г. Гуанчжоу — разработаны критерии контроля качества иммунореагентов для использования в разрабатываемых иммунохимических тест-системах. Изучено влияние компонентов реакционной среды на кинетику и специфичность иммунного взаимодействия при детекции ветеринарных препаратов с использованием разработанных методик иммуноанализа. Китайские партнеры принимали активное участие в проведении совместных испытаний экспериментальных образцов разработанных тест-систем. Охарактеризованы методические решения, обеспечивающие полноту выявления целевых соединений в матриксах проб сложного состава. Проведена оценка конкурентного потенциала разработанных тест-систем.

Подведен итог выполненных работ и проведено обобщение результатов исследований за весь период работ, включающий оценку эффективности полученных результатов в сравнении с современным научно-техническим уровнем.

Состав выполненных работ удовлетворяет условиям Соглашения о предоставлении субсидии, в том числе Техническому заданию и Плану-графику исполнения обязательств. Результаты выполненных работ соответствует требованиям Технического задания и нормативной документации. Содержание отчётной документации соответствует условиям Соглашения о предоставлении субсидии, в том числе Техническому заданию и Плану-графику исполнения обязательств.

Обязательства получателя субсидии исполнены надлежащем образом и в полном объеме.


Проект: Разработка и характеристика методов ин витро тестирования для оценки безопасности техногенных наночастиц и содержащей их нанотехнологической продукции
Номер проекта: 14.616.21.0017
Мероприятие ФЦП: 2.2
Руководитель работ: Дзантиев Борис Борисович
Сроки выполнения: 2014 г.
Общий объем бюджетного и привлеченного финансирования: 18,8 млн. руб.

V

Поиск и разработка методов оценки безопасности и потенциальных рисков наноматериалов и нанотехнологической продукции, основанных на in vitro тестировании. Экспериментальная характеристика эффективности предложенного комплекса методов для оценки биологического действия приоритетных видов наночастиц.

Разработка методов оценки безопасности и потенциальных рисков наноматериалов и нанотехнологической продукции, к которым относится выполненный в данном проекте анализ биологического действия наночастиц в отношении клеточных тест-систем, позволит быстро и информативно получить информацию о токсических эффектах наноматериалов, что крайне актуально для осуществления скринингового контроля биобезопасности наночастиц, позволит сформировать критерии влияния наноматериалов на метаболические процессы и охарактеризовать особенности ответов, вызванных экспозицией наноматериалами. Результаты, полученные при изучении действия наночастиц на различные клеточные линии, могут использоваться для оперативной оценки влияния техногенных наноматериалов на изменение биохимических параметров в живых организмах. Это позволит провести адекватную оценку рисков техногенных наноматериалов и разработать эффективную стратегию снижения рисков.

V

Проведен сравнительный анализ существующих методов априорной оценки безопасности техногенных наночастиц (ТНЧ) и содержащей их нанотехнологической продукции, используемых в отечественной и зарубежной практике.

Проведен анализ требований к референсным материалам, используемым для стандартизации методов детекции ТНЧ и оценки их биологического действия. Экспериментально охарактеризованы существующие и кандидатные референсные материалы, включая оценку их размеров, формы, гетерогенности препаратов, степени агрегированности в различных средах.

Разработан и экспериментально апробирован комплекс методов выделения, очистки, идентификации и определения содержания ТНЧ в биоматериале, включающий 5 групп ТНЧ, приоритетных для контроля биобезопасности. Проведен сравнительный анализ методов выделения, очистки, идентификации и определения содержания ТНЧ в биоматериале, используемых в отечественной и зарубежной практике. Подготовлена заявка на Евразийский патент по пробоподготовлке сложных биоматриксов для детекции ТНЧ.

Разработан и экспериментально апробирован комплекс методов ин витро тестирования биологического действия ТНЧ, включающий эксперименты с использованием 2 клеточных культур. Проведен сравнительный анализ методов ин витро тестирования биологического действия ТНЧ, используемых в отечественной и зарубежной практике. Осуществлен сравнительный анализ методов прогнозирования приоритетных органов-мишеней для ТНЧ при разных режимах экспозиции, используемых в отечественной и зарубежной практике. Представлен сравнительный анализ методов прогнозирования комплексного действия ТНЧ на живые организмы и экосистемы, используемых в отечественной и зарубежной практике.

Результаты работ обсуждались с зарубежным партнером на двусторонних семинарах, а также с привлечением участников проекта «MAnaging RIks of NAnomaterials». Подготовлен протокол о дальнейшем сотрудничестве в рамках международных проектов по нанобиобезопасности.


ПроектРазработка иммуноаналитического набора для высокочувствительного внелабораторного мониторинга токсичных контаминант, основанного на применении новых нанодисперсных маркеров и амплификации сигнала
Номер проекта: 14.613.21.0040
Мероприятие ФЦП: 2.1
Руководитель работ: Дзантиев Борис Борисович
Сроки выполнения: 2015-2016 гг.
Общий объем бюджетного и привлеченного финансирования: 28,056944 млн. руб.

V

Цель выполнения научно-исследовательской работы – разработать и апробировать новый аналитический набор для высокочувствительного мониторинга токсичных контаминант, основанный на применении в иммунохроматографическом анализе новых нанодисперсных маркеров и амплификации сигнала. В результате проведенных исследований должны быть разработаны новые методические решения, обеспечивающие снижение предела обнаружения иммунохроматографии по сравнению с традиционными форматами анализа.

Разрабатываемый новый аналитический набор, представляющий собой комплект иммунохроматографических тест-систем и средств концентрирования и пробоподготовки, должен обеспечивать возможность мониторинга объектов окружающей среды и сельскохозяйственной продукции. Аналитический набор должен предназначаться для определения следовых количеств токсичных контаминант: пестициды (сульфомочевины, пиретроиды), детергенты, антибиотики (нитрофураны, бета-агонисты), попадающих в объекты окружающей среды, продукты питания. Аналитический набор должен определять наличие и содержание пищевых токсикантов в объектах окружающей среды (природная и питьевая вода, почвы) и пищевых продуктах животного происхождения (молоко, мясо, продукты их переработки).

V

В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от 11 ноября 2015 г. № 14.613.21.0040 с Минобрнауки России в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» на этапе № 1 в период с 11 ноября 2015 г. по 31 декабря 2015 г. выполнялись следующие работы: .
1. Аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему, исследуемую в рамках исследований, в том числе обзор научных информационных источников: статьи в ведущих зарубежных и (или) российских научных журналах, монографии и (или) патенты).
2. Патентные исследования в соответствии с ГОСТ 15.011-96.
3. Теоретическая оценка взаимосвязей между характеристиками антител и маркеров, используемых в иммунохроматографии, и пределом детекции целевого аналита; оценка факторов, лимитирующих предел обнаружения иммунохроматографического анализа.
4. Разработка согласованных с иностранным партнером требований к характеристикам препаратов антител, нанодисперсных маркеров и их конъюгатов, методик измерений данных характеристик.
5. Экспериментальная характеристика антител, используемых для разработки аналитического набора, определение их аффинности и специфичности.
6. Экспериментальная характеристика нанодисперсных маркеров, используемых для разработки аналитического набора, определение чувствительности и точности их детекции при проведении анализа на мембранных носителях.
7. Теоретическая характеристика возможностей снижения предела обнаружения в иммунохроматографическом анализе при использовании новых видов маркеров и систем амплификации сигнала.
8. Разработка и согласование с иностранным партнером требований к характеристикам препаратов антител, нанодисперсных маркеров и их конъюгатов, методик измерений данных характеристик.
9. Методика измерений характеристик препаратов антител, нанодисперсных маркеров и их конъюгатов.
10. Сравнительный анализ методических решений по амплификации сигнала в иммунохроматографических системах.
11. Оценка влияния разных методов амплификации на уровень специфического и неспецифического сигнала в иммунохроматографических системах.
12. Сравнительная оценка существующих способов пробоподготовки для иммунодетекции токсичных контаминант окружающей среды и продуктов питания.

Получены следующие основные результаты:
В рамках первого этапа работ проведен анализ литературных источников по теме исследований. Проведены патентные исследования, подтверждающие актуальность и новизну тематики проекта. Проведена теоретическая оценка взаимосвязей между характеристиками антител и маркеров, используемых в иммунохроматографии, и пределом детекции целевого аналита; оценка факторов, лимитирующих предел обнаружения иммунохроматографического анализа. Разработаны согласованные с иностранным партнером требования к характеристикам препаратов антител, нанодисперсных маркеров и их конъюгатов, методик измерений данных характеристик. Экспериментально охарактеризованы антитела и нанодисперсные маркеры, используемые для разработки аналитического набора.

Основными параметрами, использованными для характеристики антител, являлись:
· связывание антител с иммобилизованным конъюгатом целевого антигена и белкового носителя;
· конкурентное взаимодействие антител при введении в систему антитело-конъюгат определяемого соединения;
· специфичность взаимодействия с определяемым соединением;
· достигаемая чувствительность определения в методе иммуноферментного анализа, а также характеристики рабочего диапазона определяемых концентраций.

Соответствующие тестирования были проведены для препаратов антител против целевых антигенов проекта – представителей пестицидов (сульфомочевины, пиретроиды), детергентов, антибиотиков (нитрофураны, бета-агонисты),

Характеристика колориметрических нанодисперсных маркеров заключалась в оценке их размерных параметров методами просвечивающей электронной микроскопии и динамического рассеяния света, а также в оценке их спектральных свойств. Проведено тестирование следующих колориметрических маркеров:
· коллоидное золото;
· окрашенные латексные частицы.

Теоретически охарактеризованы возможности снижения предела обнаружения в иммунохроматографическом анализе при использовании новых видов маркеров и систем амплификации сигнала. Разработаны методики измерений, планируемые к использованию при характеристике препаратов антител, нанодисперсных маркеров и их конъюгатов.

Иностранным партнером – Школа продовольственной науки и техники Университета ЖиангНан, г. Вуси (School of Food Science and Technology, JiangNan University), Китай – проведен сравнительный анализ методических решений по амплификации сигнала в иммунохроматографических системах. Проанализировано влияние разных методов амплификации на уровень специфического и неспецифического сигнала в иммунохроматографических системах. Сопоставлены существующие способы пробоподготовки для иммунодетекции токсичных контаминант окружающей среды и продуктов питания.

В целом выполненные работы обеспечивают необходимый базис для решения задач заключительного этапа выполнения проекта и свидетельствуют о высокой степени функциональности отобранных для использования в аналитических системах специфических реагентов.

Состав выполненных работ удовлетворяет условиям Соглашения о предоставлении субсидии, в том числе Техническому заданию и Плану-графику исполнения обязательств. Результаты выполненных работ соответствует требованиям Технического задания и нормативной документации. Содержание отчётной документации соответствует условиям Соглашения о предоставлении субсидии, в том числе Техническому заданию и Плану-графику исполнения обязательств.

Полученные экспериментальные результаты не противоречат литературным данным. Направление исследований соответствует мировым тенденциям в данной области.

Обязательства получателя субсидии исполнены надлежащем образом и в полном объеме.

V

В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от 11 ноября 2015 г. № 14.613.21.0040 с Минобрнауки России в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» на этапе № 2 в период с 1 января 2016 г. по 31 декабря 2016 г. выполнялись следующие работы:

– Конъюгирование антител с нанодисперсными маркерами (коллоидным золотом и латексными частицами) при разных условиях проведения взаимодействия.
– Характеристика состава полученных конъюгатов и степени сохранения функциональных свойств.
– Выявление влияния условий синтеза на характеристики полученных конъюгатов наночастиц с антителами.
– Разработка согласованных с китайским партнером требований к панелям проб объектов окружающей среды и продуктов питания.
– Формирование с иностранным партнером панелей проб для апробации аналитического набора для детекции токсичных контаминант: пестицидов, детергентов и антибиотиков.
– Разработка программы и методик испытаний экспериментальных образцов аналитического набора.
– Выбор и обоснование оптимальных протоколов проведения анализа.
– Проведение дополнительных патентных исследований.
– Изготовление экспериментальных образцов аналитического набора.
– Экспериментальное изучение взаимодействий в мембранных иммунохроматографических системах, реализуемых с использованием новых нанодисперсных маркеров и систем амплификации.
– Апробация экспериментальных образцов аналитического набора для тестирования проб реальных образцов объектов окружающей среды и продуктов питания.
– Проведение подтверждающих анализов содержания контаминант (пестицидов, детергентов и антибиотиков) в тестируемых пробах с использованием хроматографических методов.
– Оценка эффективности реализованных методических решений по снижению предела обнаружения в иммунохроматографическом анализе.
– Подготовка лабораторного регламента изготовления разработанного аналитического набора с учетом результатов совместных испытаний.
– Разработка инструкции по применению аналитического набора для определения токсичных контаминант.
– Подготовка рекомендаций по применению результатов проекта и их вовлечению в хозяйственный оборот.
– Разработка плана использования результатов проекта, полученных совместно с иностранным партнером.

Иностранным партнером — Школа продовольственной науки и техники Университета ЖиангНан, г. Вукси (School of Food Science and Technology, JiangNan University), Китай — выполнены следующие работы:

– Охарактеризована специфичность разработанного аналитического набора при контроле структурно близких соединений, относящихся к классам детергентов, пестицидов или антибиотиков.
– Охарактеризована стабильность разработанного аналитического набора при разных режимах хранения, включая режим ускоренного старения.
– Проведены совместные испытания экспериментальных образцов разработанного аналитического набора.
– Проведена оценка эффективности разработанных подходов для контроля различных классов контаминант.
– Проведена оценка конкурентного потенциала разработанного аналитического набора.

Получены следующие основные результаты работ:
В рамках второго этапа работ получены конъюгаты нанодисперсных маркеров (коллоидного золота и латексных частиц) с антителами, изучено влияние условий синтеза на характеристики полученных иммунных комплексов. Разработаны согласованные с китайским партнером требования к панелям проб объектов окружающей среды и продуктов питания, на основании которых сформирована панель проб для апробации аналитического набора. Выбраны оптимальные условия проведения анализа с использованием разработанного аналитического набора. Изготовлены и апробированы экспериментальные образцы аналитического набора, для которых проведена оценка условий хранения, чувствительности и специфичности, определены аналитические характеристики (пределы детекции и рабочие диапазоны).

Подготовлены и поданы две заявки на патенты по результатам исследований:
1)    Способ иммунохроматографического определения низкомолекулярных соединений с прямой концентрационной зависимостью регистрируемого окрашивания;
2)    Способ повышения интенсивности окрашивания иммунохроматографической тест-полоски с использованием неспецифических иммуноглобулинов.

Проведены совместные с китайским партнером испытания экспериментальных образцов аналитического набора. Разработаны следующие документы:
— программа и методики испытаний экспериментальных образцов аналитического набора;
— лабораторный регламент изготовления разработанного аналитического набора с учетом результатов совместных испытаний;
— инструкция по применению аналитического набора для определения токсичных контаминант;
— рекомендации по применению результатов проекта и их вовлечению в хозяйственный оборот;
— план использования результатов проекта, полученных совместно с иностранным партнером.

По результатам работ опубликовано две статьи в журналах, рецензируемых в базе данных Web of Science и Scopus:
1) Comparative characteristics of nanodisperse markers for immunochromatographic test systems;
2) Formats of sensitive immunochromatographic assay: Comparative study on the example of herbicide atrazine


Проект: Разработка новых методов экспрессной детекции био- и антропогенных низкомолекулярных токсикантов для контроля пищевых продуктов растительного и животного происхождения
Номер проекта: 14.616.21.0061
Мероприятие ФЦП: 2.2
Руководитель работ: Дзантиев Борис Борисович
Сроки выполнения: 2015-2016 гг.
Общий объем бюджетного и привлеченного финансирования: 23,584268 млн. руб.

V

Цель выполнения научно-исследовательской работы – разработать и апробировать новые иммуноаналитические системы для мониторинга био- и антропогенных низкомолекулярных токсикантов в пищевой продукции растительного и животного происхождения. В результате проведенных исследований должны быть разработаны новые методические решения, которые на основании использования новых флуоресцентных маркеров и форматов анализа обеспечивают снижение предела детекции токсичных контаминант по сравнению с существующими методами и позволяют проводить экспрессное тестирование.

Разрабатываемые иммуноаналитические системы должны обеспечивать контроль качества и безопасности продуктов питания (молоко, мясо, продукты их переработки) в части выявления в них наличия и содержания токсичных контаминант (бета-агонисты, бактериостатики и др.). Результатом применения разрабатываемых иммуноаналитических систем в соответствии с методиками их применения должен быть вывод о пригодности или непригодности к использованию тестируемых пищевых продуктов.

V

В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от 11 ноября 2015 г. № 14.616.21.0061 с Минобрнауки России в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» на этапе № 1 в период с 11 ноября 2015 г. по 31 декабря 2015 г. выполнялись следующие работы: .
1. Аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему, исследуемую в рамках исследований, в том числе обзор научных информационных источников: статьи в ведущих зарубежных и (или) российских научных журналах, монографии и (или) патенты).

2. Патентные исследования в соответствии с ГОСТ 15.011-96.

3. Характеристика аффинности препаратов немодифицированных антител против низкомолекулярных токсикантов пищевой продукции (представителей бета-агонистов и бактериостатиков), применяемых в разрабатываемых аналитических системах, методами иммуноферментного анализа.

4. Конъюгирование препаратов антигенов и антител с низкомолекулярными и нанодисперсными флуоресцентными маркерами при разных условиях проведения взаимодействия, очистка полученных конъюгатов.

5. Определение кинетических и равновесных параметров взаимодействий между реагентами для иммунодетекции токсичных контаминант пищевой продукции (представителей бета-агонистов и бактериостатиков) с использованием биосенсорного иммуноанализа с регистрацией поверхностного плазмонного резонанса.

6. Подготовка и паспортизация препаратов нативных и модифицированных иммунореагентов для включения в панель препаратов, используемых в совместных с итальянской стороной экспериментах по разработке новых иммуноаналитических методов.

7. Разработка согласованных с итальянской стороной требований к протоколам проведения экспериментов и формам представления результатов при разработке иммуноаналитических систем.

8. Теоретическая и экспериментальная характеристика влияния новых маркеров и форматов проведения иммуноанализа на пределы выявления токсичных контаминант.

9. Характеристика селективности препаратов немодифицированных антител против низкомолекулярных токсикантов пищевой продукции (представителей бета-агонистов и бактериостатиков), применяемых в разрабатываемых аналитических системах.

10. Подготовка и паспортизация препаратов нативных и модифицированных иммунореагентов для включения в панель препаратов, используемых в совместных с российской стороной экспериментах по разработке новых иммуноаналитических методов.

11. Разработка методических решений для высокопроизводительной и экспрессной пробоподготовки для иммунодетекции токсичных контаминант пищевой продукции (представителей бета-агонистов и бактериостатиков).

Получены следующие основные результаты:

Подготовлен аналитический обзор современной научнотехнической, нормативной и методической литературы. Проведены патентные исследования по теме проекта. Проведена характеристика аффинности и селективности препаратов немодифицированных антител против низкомолекулярных токсикантов пищевой продукции (представителей бета-агонистов и бактериостатиков). Получены конъюгаты антигенов и антител с низкомолекулярными нанодисперсными флуоресцентными маркерами. Определены кинетические и равновесные параметры взаимодействий между реагентами. Проведена паспортизация препаратов нативных и модифицированных иммунореагентов. Разработаны методические решения для высокопроизводительной и экспрессной пробоподготовки для иммунодетекции токсичных контаминант пищевой продукции.

Состав выполненных работ удовлетворяет условиям Соглашения о предоставлении субсидии, в том числе Техническому заданию и Плану-графику исполнения обязательств. Результаты выполненных работ соответствует требованиям Технического задания и нормативной документации. Содержание отчётной документации соответствует условиям Соглашения о предоставлении субсидии, в том числе Техническому заданию и Плану-графику исполнения обязательств.

Обязательства получателя субсидии исполнены надлежащем образом и в полном объеме.

V

В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от 11 ноября 2015 г. №14.616.21.0061 с Минобрнауки России в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» на этапе № 2 в период с 01 января 2016 г. по 31 декабря 2016 г. выполнялись следующие работы:

1. Экспериментальное изучение взаимодействий между иммунореагентами в разрабатываемых аналитических системах для детекции низкомолекулярных токсикантов пищевой продукции (представителей бета-агонистов и бактериостатиков).
2. Выбор и обоснование оптимальных сочетаний реагентов для новых методов контроля низкомолекулярных токсикантов.
3. Выбор и обоснование оптимальных протоколов проведения анализа.
4. Проведение дополнительных патентных исследований. Подготовка и подача двух заявок на патенты для защиты интеллектуальной собственности на методические решения, предложенные в ходе выполнения проекта.
5. Подготовка и паспортизация препаратов пищевых продуктов растительного и животного происхождения для включения в панель препаратов, используемых в совместных с итальянской стороной экспериментах по испытаниям разработанных иммуноаналитических систем.
6. Изготовление экспериментальных образцов тест-систем для детекции низкомолекулярных токсикантов пищевой продукции (представителей бета-агонистов и бактериостатиков).
7. Разработка программы и методик испытаний экспериментальных образцов тест-систем.
8. Апробация экспериментальных образцов тест-систем для контроля пищевых продуктов растительного и животного происхождения, в соответствии с разработанной программой и методиками испытаний.
9. Характеристика точности и воспроизводимости результатов изменений содержания низкомолекулярных токсикантов разработанными методами.
10. Сравнительная оценка возможностей применения новых флуоресцентных маркеров для высокочувствительнойдетекциибио- и антропогенных низкомолекулярных токсикантов.
11. Экспериментальное изучение эффективности разработанных новых методов экспрессной детекции для контроля низкомолекулярных токсикантов других классов.
12. Характеристика стабильности разработанных тест-систем при разных режимах хранения.
13. Подготовка лабораторных регламентов изготовления разработанных тест-систем для определения бета-агонистов и бактериостатиков с учетом результатов совместных испытаний.
14. Подготовка рекомендаций по применению результатов проекта и их вовлечению в хозяйственный оборот, в том числе по взаимодействию с потенциальными изготовителями и потребителями аналитических наборов.
15. Разработка плана использования результатов проекта, полученных совместно с итальянским партнером.
16. Подготовка и паспортизация препаратов пищевых продуктов растительного и животного происхождения для включения в панель препаратов, используемых в совместных с российской стороной экспериментах по испытаниям разработанных иммуноаналитических систем.
17. Участие в проведении совместных испытаний экспериментальных образцов разработанных тест-систем.
18. Проведение подтверждающих анализов содержания низкомолекулярных токсикантов в тестируемых пробах с использованием хроматографических методов для оценки эффективности разработанных методов.
19. Сравнение разработанных тест-систем с альтернативными средствами контроля низкомолекулярных токсикантов пищевой продукции; оценка конкурентного потенциала разработанных тест-систем.

Получены следующие основные результаты:
Экспериментально изучены взаимодействия между иммунореагентами в разрабатываемых аналитических системах, выбраны и обоснованы оптимальные сочетания реагентов и протоколы проведения анализа. Поданы две заявки на патенты для защиты интеллектуальной собственности. Изготовлены экспериментальные образцы тест-систем для детекции низкомолекулярных токсикантов пищевой продукции (представителей бета-агонистов и бактериостатиков) и проведена их апробация для контроля пищевых продуктов растительного и животного происхождения. Проведена характеристика точности, воспроизводимости, стабильности измерений. Подготовлена техническая документация по производству и проведению опытных испытаний тест-систем. Проведены совместные с иностранным партнером испытания экспериментальных образцов тест-систем и подтверждающие анализы с использованием хроматографических методов. Подготовлены рекомендации по применению результатов проекта и их вовлечению в хозяйственный оборот.

Состав выполненных работ удовлетворяет условиям Соглашения о предоставлении субсидии, в том числе Техническому заданию и Плану-графику исполнения обязательств. Результаты выполненных работ соответствуют требованиям Технического задания и нормативной документации. Содержание отчётной документации соответствует условиям Соглашения о предоставлении субсидии, в том числе Техническому заданию и Плану-графику исполнения обязательств.

Обязательства получателя субсидии исполнены надлежащем образом и в полном объеме.


Проект: Скрининг нейропротекторных соединений-ингибиторов метаболизма глутамина
Номер проекта: 14.604.21.0116
Мероприятие ФЦП: 1.2
Руководитель работ: Красников Борис Федорович
Сроки выполнения: 2014-2016 гг.
Общий объем бюджетного и привлеченного финансирования: 25,97 млн. руб.

V

выбор предиктивного диагностического биомаркера для оценки риска развития печёночной энцефалопатии (ПЭ), разработке метода его определения и выявлении мишеней для новых методов лечения энцефалопатий, вызванных нарушениями работы печени.

Конкретные экспериментальные задачи 1-го этапа (Наименование этапа: «Выбор направления исследований, теоретические и экспериментальные исследования поставленных перед ПНИ задач»):

  1. Проведение анализа литературы по теме ПНИ и выполнение аналитического обзора современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему, исследуемую в рамках ПНИ, в том числе, обзор научных информационных источников, включающих статьи в ведущих зарубежных и российских научных журналах и монографиях.
  2. Проведение патентных исследований в соответствии ГОСТ Р 15.011-96
  3. Разработка плана исследований по созданию ингибиторов глутаминтрансаминазы (ГТ) и ω-амидазы человека.
  4. Разработка рекомбинантного продуцента ω-амидазы человека на базе дрожжей Yarrowia lipolytica.
  5. Разработка лабораторной методики культивирования рекомбинантного продуцента ω-амидазы человека на базе Y. lipolytica.
  6. Разработка лабораторной методики очистки ω-амидазы человека из биомассы рекомбинантных клеток Y. lipolytica.
  7. Разработка лабораторной методики определения активности ω-амидазы человека (природной и очищенной из биомассы рекомбинантных клеток
  8. lipolytica).
  9. Разработка рекомбинантного продуцента ГТ человека на базе Y. lipolytica и метода получения ГТ человека в клетках рекомбинантных продуцентов Y. lipolytica.
  10. Разработка лабораторной методики культивирования рекомбинантного продуцента ГТ человека на базе Y. lipolytica.
  11. Разработка лабораторной методики очистки ГТ человека из биомассы рекомбинантных клеток Y. lipolytica.
  12. Разработка лабораторной методики определения активности ГТ человека.

V

Работа по первому промежуточному отчетному периоду целиком направлена на выбор направления исследований, теоретические и экспериментальные исследования поставленных перед ПНИ задач.В течение отчетного периода работы были получены следующие результаты:

  1. Оформлен аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы.
  2. Проведены патентные исследования в соответствии ГОСТ Р 15.011-96
  3. Разработан план исследований по созданию ингибиторов ГТ и ω-амидазы человека.
  4. Сконструирован рекомбинантный продуцент ω-амидазы человека на базе Y. lipolytica.
  5. Разработана лабораторная методика культивирования рекомбинантного продуцента ω-амидазы человека на базе Y. lipolytica.
  6. Разработана лабораторная методика очистки ω-амидазы человека из биомассы рекомбинантных клеток Y. lipolytica.
  7. Разработана лабораторная методика определения активности ω-амидазы человека (природной и очищенной из биомассы рекомбинантных клеток Y. lipolytica).
  8. Сконструирован рекомбинантный продуцент ГТ человека на базе Y. lipolytica .
  9. Разработана лабораторная методика культивирования рекомбинантного продуцента ГТ человека на базе Y. lipolytica.
  10. Разработана лабораторная методика очистки ГТ человека из биомассы рекомбинантных клеток Y. lipolytica.
  11. Разработана лабораторная методика определения активности ГТ человека (природной и очищенной из биомассы рекомбинантных клеток Y. lipolytica).
  12. Подведены итоги этапа. Оформлена отчетная документация.
  13. Проведено материально-техническое обеспечение работ этапа. Таким образом, на первом отчетном этапе представлены все необходимые данные об осуществленных работах, направленных в первую очередь на выбор направления исследований, теоретические и экспериментальные исследования поставленных перед ПНИ задач, а также представлены все необходимые методики, паспорта и другие документы, позволяющие говорить об успешном завершении данного этапа работы.

V

В течение отчетного периода работы были получены следующие результаты:
1. Составлен лабораторный регламент изготовления тест-системы для отбора соединений, обладающих нейропротективными свойствами, позволяющей оценивать уровень ингибирования основных ферментов метаболизма аммиака в мозге: глутаминтрансаминазы К (ГТ-К) и ω-амидазы NIT2 потенциальными соединениями нейропротекторами.
2. Изготовлены экспериментальные образцы тест-систем для отбора соединений, обладающих нейропротективными свойствами. Экспериментальные образцы тест-систем были сконструированы на основе 10 образцов ферментативных комплексов ГТ-К и ω-амидазы NIT2 (коммерческих препаратов, ферментов из гомогенатов печени крыс и целевых ферментов, выделенных из трансформантных линий дрожжей Y. lipolytica W29, несущих экспрессионные конструкции pQ-UGT (на основе гена ГТ (CCBL1)) и pQ-UNit (на основе гена ω-амидазы (NM_020202.4; NIT2 человека).
3. Разработан проект инструкции по применению аналитической тест-системы, позволяющий реализовывать план исследований по разработке потенциальных нейропротекторов-ингибиторов метаболизма глутамина.
4. На животных (аутбредная линия крыс Wistar) разработана экспериментальная модель патогенеза нейродегенеративных заболеваний на основе печёночной энцефалопатии (in vivo).
5. Проведена валидация экспериментальной модели и тест-системы (ферментативных комплексов ГТ-К и ω-амидазы NIT2) с использованием набора 5 веществ-блокаторов этих ферментов, обладающих потенциальными нейропротективными свойствами.
6. Проведен скрининг химических библиотек соединений, разрешенных для фармацевтического применения в РФ, с целью подбора физиологически безопасных ингибиторов ω-амидазы. На основании анализа литературных данных о структуре активного центра фермента, данных, представленных в белковой базе ProteinDataBank (http://www.rcsb.org) и базе данных химических веществ ChemSpider (http://www.chemspider.com) , проведен докинг 61 кандидатного соединения и отобрано 21 соединение, обладающее высокой энергией связывания с ферментом.
7. Проведен скрининг химических библиотек соединений, разрешенных для фармацевтического применения в РФ, с целью подбора физиологически безопасных ингибиторов ГТ-К. На основании анализа литературных данных о структуре активного центра фермента, данных, представленных в белковой базе ProteinDataBank (http://www.rcsb.org) и базе данных химических веществ ChemSpider (http://www.chemspider.com) , проведен докинг 61 кандидатного соединения и отобрано 8 соединений, обладающих высокой энергией связывания с ферментом.

V

  1. Разработан новый и быстрый метод определения уровней aКГМ в биологических образцах на базе использования метода HPLC-анализа, проведена его валидация, установлены границы аналитической вариабельности для стандартных раствором в пределах < 3 % и для биологических образцов в пределах 0-7 %. Лимит детекции aКГМ в стандартных образцах был < 80 нМ, воспроизводимость измерений в биологических образцах была на уровне 99%. Разработан экспресс-метод колориметрический определения aКГМ в биологических жидкостях человека и животных, отличающийся простотой и высокой скоростью – 96 образцов в течение 1 часа.
  2. Разработаны методы определения активности двух ферментов, являющихся компонентами аналитической тест-системы: ω-амидазы и ГТ-К. Для определения активности этих ферментов было решено использовать кинетический метод анализа, как наиболее подходящий для детального ингибиторного анализа и для скринирования химических библиотек ингибиторов. Разработаны и апробированы протоколы для измерения активности ферментов аналитической тест-системы в биологических образцах. Проведена проверка эффективности аналитической тест-системы при оценке скорости развития печеночной энцефалопатии (ПЭ).
  3. На базе разработанного метода анализа aКГМ, были проанализированы образцы тканей почек, печени, мозга, а также плазмы крови животных в моделях хронического эксперимента ПЭ. При снижении уровней aКГМ в тканях печени, мозга и в плазме крови¸ происходило одновременное повышение уровня синтеза aКГ. В тканях почек хронического эксперимента наблюдалось существенное снижения уровня aКГМ на фоне прироста уровня aКГ в доза-зависимой группе крыс. плазме крови, на фоне существенного снижения уровня aКГМ, наблюдался рост выхода aКГ.
  4. В процессе HPLC-анализа по определению уровня αКГМ в биологических образцах крыс, в тканях почек и печени животных был выявлен сильный потенциальный биомаркер развития ПЭ. В тканях мозга и в плазме крови данный биомаркер отсутствовал. Концентрация неизвестного метаболита в тысячи (почки) и в десятки (печень) раз превышала концентрацию данного метаболита в контрольных образцах крыс хронического эксперимента. В связи с тем, что разработанный метод HPLC ориентирован прежде всего на анализ высокополярных соединений, существует вероятность того, что наряду с αКГМ этот неизвестный метаболит может присутствовать и в моче животных с развитием ПЭ.
  5. За отчетный период по результатам работы опубликовали две статьи в журналах AMINOACIDS и ANALYTICAL BIOCHEMISTRY.


Проект: Разработка прототипов генетических конструкций для коррекции митохондриальных дисфункций и методов их введения в клетки
Номер проекта: 14.604.21.0112
Мероприятие ФЦП: 1.2
Руководитель работ: Исакова Елена Павловна
Сроки выполнения: 2014-2016 гг.
Общий объем бюджетного и привлеченного финансирования: 19,7 млн. руб.

V

Проект направлен на разработку структуры генетической конструкции на основе природной митохондриальной ДНК человека, реплицирующейся в клетках дрожжей Yarrowia lipolytica, для коррекции митохондриальных дисфункций человека: митохондриальной миопатии с молочно-кислым ацидозом и инсультоподобными эпизодами (MELAS) и миоклональной эпилепсии с синдромом рваных красных волокон (MERRF).Разработка метода доставки генетической конструкции в митохондрии при помощи использования гомологичной рекомбинации с целью дальнейшей коррекции митохондриальных дисфункций MELAS и MERRF. Разработка методики оценки эффективности действия разработанной генетической конструкции, предназначенной для коррекции митохондриальных дисфункций MELAS и MERRF с помощью новой клеточной модели на основе дрожжей Yarrowia lipolytica.

V

В рамках первого этапа проекта работа включала теоретические и экспериментальные исследования в области создания средств коррекции дефектов митохондриального генома человека. В результате были получены следующие основные результаты:Составлен аналитический обзор информационных источников, посвященный описанию этиологии, клиники и паталогической физиологии митохондриальных болезней, методам их медикаментозного лечения.Проведены патентные исследования по теме ПНИ. Проведена сравнительная оценка эффективности возможных направлений исследований, проанализированы возможные механизмы доставки разрабатываемой генетической конструкции в митохондрии, теоретически обоснована структура предлагаемой к разработке генетической конструкции для практического решения задач по коррекции митохондриальных дисфункций MELAS и MERRF.Разработана конструкция для введения в клетки Y. lipolytica гена белка RecA бактериального происхождения, транскрипт которого содержит адресные последовательности митохондриальной локализации (SOD-5’UTR и SOD-3’UTR).Разработан экспериментальный протокол количественной оценки уровня продукции белка RecA бактериального происхождения в клетках Y. lipolytica.Проведено материально-техническое обеспечение работ этапа. Таким образом, на первом отчетном этапе получены все основные результаты, предусмотренные Соглашением и приложениями к нему, а также представлены все необходимые документы, позволяющие говорить об успешном завершении данного этапа работы.

V

В рамках выполнения второго этапа проекта проведены разработка и получение синтетического гена устойчивости к гигромицину, по кодоновому составу и организации старта трансляции адаптированного для экспрессии в митохондриях Y. Lypolytica. Получена генетическая конструкция в форме линейной двунитевой ДНК для введения в состав митохондрального генома Y. lipolytica путем гомологичной рекомбинации с 3′-UTR оперона 1. Оценена эффективность введения линейной ДНК-конструкции в митохондриальный геном. Получены трансформанты дрожжей, несущих генетическую конструкцию в форме линейной двунитевой ДНК в состав митохондрального генома Y. lipolytica. Разработан лабораторный регламент получения генетической конструкции для коррекции митохондриальных дисфункций MELAS и MERRF. Проведено материально-техническое обеспечение работ этапа. Таким образом, на втором отчетном этапе получены все основные результаты, предусмотренные Соглашением и приложениями к нему, а также представлены все необходимые документы, позволяющие говорить об успешном завершении данного этапа работы.

V

В рамках выполнения третьего этапа проекта проведена разработка и получение синтетического гена устойчивости к гигромицину, по кодоновому составу и организации старта трансляции адаптированного для экспрессии в митохондриях Y.  Lypolytica. Получена генетическая конструкция в форме линейной двунитевой ДНК для введения в состав митохондрального генома Y. lipolytica путем гомологичной рекомбинации с 3’-UTR оперона 1. Оценена эффективность введения линейной ДНК-конструкции в митохондриальный геном. Получены трансформанты дрожжей, несущих генетическую конструкцию в форме линейной двунитевой ДНК в состав митохондрального генома Y. lipolytica. Разработан лабораторный регламент получения генетической конструкции для коррекции митохондриальных дисфункций MELAS и MERRF. Проведено материально-техническое обеспечение работ этапа. Таким образом, на третьем отчетном этапе получены все основные результаты, предусмотренные Соглашением и приложениями к нему, а также представлены все необходимые документы, позволяющие говорить об успешном завершении данного этапа работы.

V

В рамках выполнения четвертого этапа проекта проведена оценка эффективности введения ДНК-конструкции в митохондриальный геном Y. lipolytica в условиях селекции трансформантов по способности к росту на минимальной среде с сукцинатом в качестве единственного субстрата. Исследована жизнеспособность рекомбинантных штаммов Y. lipolytica с дефектом в генах Leu-специфичных и Lys-специфичных тРНК, в том числе, при культивировании на минимальной среде с сукцинатом в качестве единственного субстрата. Получены генетические конструкции в форме кольцевой ДНК для коррекции митохондриальных мутаций в мезенхимальных стромальных клетках человека путём выделения из клеток дрожжей.   Получены трансфектанты мезенхимальных стромальных клеток (МСК) человека, несущие геном митохондрий с искусственно восстановленной функцией генов тРНК-Lys и тРНК-Leu. Разработаны программа и методика исследовательских испытаний генетической конструкции для коррекции митохондриальных дисфункций MELAS и MERRF. Разработаны метод доставки генетической конструкции в митохондрии мезенхимальных стромальных клеток человека и метод оценки эффективности доставки в митохондрии МСК человека, поддерживаемых в культуре in vitro. Разработан метод оценки эффективности действия генетической конструкции с точки зрения востановления физиологических функций МСК человека в культуре. Таким образом, на четвертом отчетном этапе получены все основные результаты, предусмотренные Соглашением и приложениями к нему, а также представлены все необходимые документы, позволяющие говорить об успешном завершении данного этапа работы.


Проект: Разработка инструментов информационно-аналитической поддержки проведения исследований и развития деятельности национальной контактной точки (НКТ) по приоритетному направлению Продовольственные и сельскохозяйственные биотехнологии Рамочной программы по научно-технологическому и инновационному развитию Горизонт 2020 в рамках сотрудничества с Европейским союзом
Номер проекта: 14.601.21.0002
Мероприятие ФЦП: 1.1
Руководитель работ: Попов Владимир Олегович
Сроки выполнения: 2014 — 2017 гг.
Общий объем бюджетного и привлеченного финансирования: 8,9 млн. руб. 

V

Цель проекта — содействие формированию устойчивых кооперационных связей российских и европейских научно-исследовательских организаций и интеграции российской науки в общеевропейскую научно-исследовательскую сферу. 

V

Сроки выполнения работ по 1 этапу: 16 октября 2014 г. – 30 декабря 2014 г.собрана и систематизирована информация о возможностях участия российских организаций в зарубежных программах и проектах; предоставлена информация о возможностях участия европейцев в программах и проектах РФ; разработано и осуществлено методическое обеспечение участия российских организаций в программе «Горизонт-2020» и других научно-технических программах; подготовлен аналитический отчет на основе консультаций по вопросам практического участия российских исследователей в программах «Горизонт-2020»; актуализирована база данных «Биотехнологии», выполненная за 2014 год.

V

Сроки выполнения работ по 2 этапу: 01 января 2015 г. – 30 июля 2015 г.

1. Сформирован актуальный перечень конкурсов, научных программ ЕС, ведущих исследовательских организаций, в области продовольственных и сельскохозяйственных биотехнологий для участия российских организаций и исследователей
2. Разработаны и размещены на сайте НКТ информационные материалы в области продовольственных и сельскохозяйственных биотехнологий на первое полугодие 2015 г http://bio-economy.ru/biblioteka/rassylka_bio_nkt/
3. Сформирован актуальный перечень программ и проектов Российской Федерации для участия европейских исследователей.
4. Сформирована и поддерживается актуальная база европейских исследователей, организаций и фондов в области продовольственных и сельскохозяйственных технологий.
5. Разработаны методические указания по развитию навыков подготовки заявок на конкурсы международных программ в области продовольственных и сельскохозяйственных биотехнологий в 2015-2016 у представителей российского научного сообщества
6. Подготовлен аналитический отчет по вопросам практического участия российских исследователей в программе «Горизонт 2020» на основе опыта оказания консультационных услуг за 1 полугодие 2015 года

V

Сроки выполнения работ по 3 этапу: 01 июля 2015 г. – 31 декабря 2015 г.
Основные результаты, полученные на 3 этапе выполнения проекта (промежуточном):
1. На основе новых подходов к практике оказания консультационных услуг подготовлен аналитический отчет о новых подходах к практике оказания консультационных услуг российскими исследователями по вопросам участия в программе «Горизонт- 2020»;
2. Подготовлены информационные и справочные материалы, пресс-релизы по текущему участию российских организаций в научных программах и проектах ЕС в области продовольственных и сельскохозяйственных биотехнологий;
3. Проведен анализ проблем, возникающих у российских научно-исследовательских организаций в ходе подготовки и участия в международных научно-технических программах в области продовольственных и сельскохозяйственных биотехнологий и рекомендации по их преодолению;
4. Разработаны справочные и обучающие материалы для мероприятий (информационных дней/семинаров/вебинаров/конференций) по научно-техническому сотрудничеству России и Европейского союза с участием представителей российских региональных научно-образовательных центров и экспертов ЕС;
5. Подготовлены информационные и справочные материалы, пресс-релизы по текущему участию европейских организаций в научных программах и проектах РФ в области продовольственных и сельскохозяйственных биотехнологий по результатам 2015 г.

V

Сроки выполнения работ по 4 этапу: 01 января 2016 г. – 30 июня 2016 г.
Основные результаты, полученные на 4 этапе выполнения проекта (промежуточном):
1. Актуализирована информация о научных программах, фондах и проектах государств-членов Евросоюза, в рамках которых возможно сотрудничество с российскими организациями и исследователями в области продовольственных и сельскохозяйственных биотехнологий. Обновлена информация о возможностях участия российских организаций в европейских программах и проектах.
2. Разработаны материалы на основе информации, имеющейся на первое полугодие 2016 года, для размещения на сайте НКТ в информационно-коммуникационной сети Интернет, обеспечивающем развитие коммуникаций российских и европейских участников международной научно-технологической и инновационной деятельности в области продовольственных и сельскохозяйственных биотехнологий.
3. Актуализирована информация о возможностях участия европейских исследователей и исследовательских организаций в программах и проектах Российской Федерации. Доработаны инструменты информирования европейских исследователей о научном потенциале России, ведущих исследовательских организаций, программах, фондах и проектах, открытых для сотрудничества с ЕС в области продовольственных и сельскохозяйственных биотехнологиях.
4. Разработано методическое обеспечение участия российских организаций в зарубежных научно-технических программах в области продовольственных и сельскохозяйственных биотехнологий. Доработаны материалы для проведения обучающих семинаров по развитию навыков представителей российского научного сообщества, по подготовке заявок на конкурсы международных программ в области продовольственных и сельскохозяйственных биотехнологий в 2016-2017 гг.
5. Подготовлены аналитические материалы, обобщены результаты их анализа для участия в совещании профильных НКТ, проводимом Директоратом Еврокомиссии.
6. Подготовлен аналитический отчет по вопросам практического участия российских исследователей в программе «Горизонт-2020» на основе опыта оказания услуг за первое полугодие 2016 г.

V

Сроки выполнения работ по 5 этапу: 01 июля 2016 г. – 31 декабря 2016 г.
Основные результаты, полученные на 5 этапе выполнения проекта (промежуточном):
1. Обобщены первичные результаты изменений практики оказания консультационных услуг российским исследователям по вопросам участия в программе «Горизонт 2020» за 2016 год.
2. Разработаны информационные и справочные материалы по участию российских организаций в научных программах и проектах ЕС в области продовольственных и сельскохозяйственных биотехнологий.
3. Проведен анализ проблем, возникающих у российских научно-исследовательских организаций в ходе подготовки и участия в международных научно-технических программах в области сельскохозяйственных биотехнологий и разработаны рекомендации по их преодолению.
4. Разработаны материалы для проведения в 2016 году мероприятий по научно-техническому сотрудничеству России с ЕС в области продовольственных и сельскохозяйственных биотехнологий .
5. Актуализирована информация о возможностях участия европейских исследователей и исследовательских организаций в фондах, программах и проектах Российской Федерации
6. Обобщены полученные результаты и подготовлены информационные и аналитические материалы для участия в 2016 году в европейском мероприятии.

V

Основные результаты, полученные на 6 этапе выполнения проекта (промежуточном):
1 Разработка материалов на основе информации, имеющейся на первое полугодие 2017 года, для размещения на сайте НКТ в информационно-коммуникационной сети Интернет, обеспечивающем развитие коммуникаций российских и европейских участников международной научно-технологической и инновационной деятельности, в том числе в области продовольственных и сельскохозяйственных биотехнологий;2 Доработка инструментов информирования европейских исследователей о научном потенциале России, ведущих исследовательских организациях, программах, фондах и проектах, открытых для сотрудничества с ЕС в области продовольственных и сельскохозяйственных биотехнологий.3 Актуализация информации о научных программах, фондах и проектах государств-членов Евросоюза, в рамках которых возможно сотрудничество с российскими организациями и исследователями в области продовольственных и сельскохозяйственных биотехнологий в  2017 г. Обновление информации о возможностях участия российских организаций в европейских программах и проектах.4 Обобщение практики оказания консультационных услуг российским исследователям по вопросам участия в программе «Горизонт 2020» за первое полугодие 2017г.



Проекты, выполняемые Институтом микробиологии им. С.Н. Виноградского, в рамках
ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2014-2020 годы»

Проект: Получение штаммов-продуцентов сульфидов металлов из окисленных осадочных отложений хвостохранилищ добычи полиметаллических руд с использованием микробиологических, биохимических и геномных технологий
Номер проекта: № 14.604.21.0108
Мероприятие ФЦП: 1.2
Руководитель работ: Пименов Николай Викторович
Сроки выполнения: 2014-2016 гг.
Общий объем бюджетного и привлеченного финансирования: 26,25 млн. руб.

V

Цель проекта:
1. Получение новых штаммов и/или консорциумов (сообществ) сульфатредуцирующих бактерий, сохраняющих активность при низких значениях рН (<6), высоких концентрациях металлов и кислорода. Разрабатываемый научный задел cтанет основой ОТР по разработке новых эффективных биотехнологий извлечения металлов из отходов горнодобывающей и металлообрабатывающей отраслей промышленности и ОКР по созданию биореакторов для осаждения металлов сульфидогенными микроорганизмами.
2. Разработка биотехнологического метода извлечения металлов из отходов горнодобывающей промышленности на основе новых штаммов ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов.

V

1) Подготовлен аналитический обзор литературы и патентных исследований, свидетельствующий о том, что технология осаждения тяжелых металлов в виде сульфидов при низких значениях рН сообществом ацидофильных сулфатредуцирующих бактерий имеет несомненные перспективы для реализации крупнотоннажного процесса очистки промышленных сточных вод, обогащенных тяжелыми металлами.

2) Из двух хвостохранилищ, расположенных в Тисульском районе Кемеровской области были отобраны пробы для последующего метагеномного анализа и выделения сульфатредуцирующих бактерий.

3) проведен химический анализ (содержание анионов и катионов) всех отобранных образцов наддоной воды, поровых вод и донных осадков, а также выделения ДНК для метагеномного анализа структуры микробного сообщества кислых хвостохранилищ.

V

В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от 7 августа 2014 № 14.604.21.0108 с Минобрнауки России в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014- 2020 годы» на этапе № 2 в период с 30 января 2015г. по 30 июня 2015г.

Выполнялись следующие работы:
1. Поиск сульфидогенных микроорганизмов в образцах кислых осадков хвостохранилищ на основе метагеномного анализа.

2. Выявление присутствия генов устойчивости к тяжелым металлам у новых штаммов ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов.

3. Направленный поиск присутствия штаммов анаэробных сульфидогенных микроорганизмов, обладающих системами антиокислительной защиты.

4. Анализ химического состава образующихся сульфидов металлов при культивировании штаммов ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов

Были получены следующие результаты:
1. Выполнен поиск сульфидогенных микроорганизмов в образцах кислых осадков хвостохранилищ на основе метагеномного анализа. На основе вариабельного фрагмента гена 16S рибосомной РНК длиной 500 нуклеотидов был проведен таксономический анализ микробного сообщества. Вариабельный фрагмент был амплифицирован с помощью универсальных вырожденных праймеров PRK341F (CCTACGGGRBGCASCAG) и PRK806R (GGACTACYVGGGTATCTAAT). Полученные ПЦР фрагмент очищали и затем проводили его секвенирование с помощью геномного анализатора GS FLX. В результате было получено 137426 независимых нуклеотидных последовательностей фрагментов гена 16S рРНК. Большинство сульфидогенных бактерий относились к дельта-протеобактериям (Desulfobulbus, Desulfopila, Desulfocapsa, Desulfatirhabdium, Desulfovibrio, Desulfobacca, Desulfomonile) и их суммарная доля составляла около 9%. Также обнаружена вторая группа сульфидогенных бактерий которая относится к филуму Firmicutes и представлена родом Desulfosporosinus. Доля этой группы микроорганизмов составляет около 1%.

2. Выявлено присутствие генов устойчивости к тяжелым металлам у новых штаммов ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов. В геноме Desulfosporosinus sp. I2 присутствовали по меньшей мере два оперона, кодирующие комплекс RND-MFP. Оба оперона (WP_045573056/KJR49082 и WP_045573879/ KJR48138) могут быть связаны с транспортом Co, Cd и Zn и гомологичны паре CzcA/CnrA из C. metallidurans. Кроме того, в геноме Desulfosporosinus sp. I2 также присутствует несколько цинковых/кадмиевых АТРаз. Большинство их них (KJR46488, WP_045575324.1, WP_045576455) характеризовалось высоким уровнем сходства друг с другом и отсутствием у всех Desulfosporosinus за исключением штаммов I2, HMP52 и BICA1-9. Ближайшие гомологи были найдены у различных Clostridium. АТРаза WP_045576455 аннотирована в геноме как гипотетический белок.

3. Проведен направленный поиск присутствия штаммов анаэробных сульфидогенных микроорганизмов, обладающих системами антиокислительной защиты. Были проведены микробиологические и биохимические эксперименты по определению степени влияния кислорода и пероксида водорода (как продукта неполного восстановления О2 в клетках) на рост и процесс сульфатредукции, а также на активность основных ферментов антиокислительной защиты, обуславливающих относительную аэротолерантность СРБ. Было установлено, что выделенная СРБ рода Desulfovibrio является достаточно аэротолерантным микроорганизмом, что позволяет клеткам микроорганизма не только выживать, но и сохранять жизнеспособность в присутствии достаточно высоких концентраций кислорода и продуктов его неполного восстановления (клетки обладали как супероксиддисмутазной, так и пероксидазной активностями). Окислительные стрессы средней интенсивности привели к возрастанию активностей основных ферментов антиокислительной защиты на 15-40%. Анализ генома выделенного штамма Desulfovibrio sp. показал наличие в нем основных генов антиокислительной защиты, характерных для многих СРБ – кодирующих супероксиддисмутазу (sodB), десульфоферродоксин (dfx), рубреритрины (rbr1 и rbr2), рубредоксин-кислород оксидоредуктазу (roo), цитохром d убихинолоксидазу (cydA), цитохром с оксидазу (cox), тиоловую пероксидазу (tpx) и алкилгидропероксидредуктазу (ahp).

4. Был проведен анализ химического состава образующихся сульфидов металлов при культивировании штаммов ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов в присутствие повышенных концентраций железа и меди.  Основными минералами, обнаруженными в осадке, были ковеллит, CuS, макинавит, FeS, и вивианит Fe3(PO4)2×8H2O.

Результаты, полученные в первом полугодии 2015 г., будут использованы на дальнейших этапах работ.

Все задачи, поставленные на первое полугодие 2015 года, выполнены полностью.

Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.

V

В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от 7 августа 2014 № 14.604.21.0108 с Минобрнауки России в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014- 2020 годы» на этапе № 3 в период с 1 июля 2015г. по 31 декабря 2015г.

При этом были получены следующие результаты:
Все штаммы СРБ, устойчивые к низким значениям рН и высоким концентрациям металлов, выделены из осадков, загрязненных тяжелыми металлами из отходов металлургических производств. Поэтому исследование микробных сообществ кислых сточных вод хранилищ отходов металлургии, в том числе с помощью современных геномных и метагеномных подходов, может привести к обнаружению штаммов СРБ с требуемыми свойствами. Использование таких штаммов в биотехнологиях очистки может позволить разработать более простую и дешевую по сравнению с используемыми технологическими схемами активной биологической очистки сточных вод. Повышение рентабельности такой технологической схемы возможно благодаря возможности исключить этапы предварительной водоподготовки или разделения процессов сульфидогенеза и осаждения металлов.

Поскольку единичные известные штаммы СРБ, устойчивые к низким значениям рН и высоким концентрациям металлов, выделены из осадков, загрязненных тяжелыми металлами из отходов металлургических производств, представляется необходимым расширить исследование микробных сообществ кислых сточных вод хранилищ отходов металлургии, в том числе с помощью современных геномных и метагеномных подходов. Целенаправленный поиск и расширение знаний о функциональном биоразнообразии штаммов ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов, позволит вплотную подойти к разработке простой и дешевой технологической осаждения металлов в процессе сульфидогенеза.

На третьем этапе согласно ТЗ были выполнены следующие работы:
1. Была разработана лабораторная, которая относится к способам выделения чистых культур ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов, устойчивых к низким значениям рН и высоким концентрациям ионов металлов из отходов добычи сульфидных руд.

2. Были проведены работы по выделению накопительных культур ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов. Выделение накопительных культур проводили согласно разработанной методике выделения. Были получены сульфидогенные накопительные культуры из проб кислых осадков на лактате и этаноле, на пептоне и формиате, способные к росту при начальных низких значениях рН среды 2.5 и перспективные для проведения дальнейших исследований. Состав культур был исследован с помощью ДГГЭ фрагментов генов 16S рРНК. В пробах были обнаружены филотипы, принадлежащие к таким родам СРБ как Desulfosporosinus, Desulfotomaculum и Desulfovibrio.

3. Проведены работы по выделению чистых культур ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов. Чистые культуры выделяли методом предельных разведений из полученных ранее накопительных культур. После получения морфологически однородных культур проводили анализ близкой к полной последовательности гена 16S рРНК. В результате удалось выделить и идентифицировать две стабильно растущих при низких рН чистых культуры СРБ, которые были отобраны для проведения дальнейших работ: Desulfovibrio sp. OI и Desulfosporosinus sp. OL

4. Проведено культивирование выделенных штаммов ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов в условиях низких значений  рН и высокого содержания ионов металлов (Сu, Zn). Для изучения устойчивости выделенных новых штаммов ацидофильных СРБ к ионам тяжелых металлов и определения предельных для роста концентраций проводили культивирование с добавлением ионов таких металлов, как медь (Cu2+), кадмий (Cd2+), никель (Ni2+) и кобальт (Co2+). Проведенные работы по культивированию выделенных новых штаммов ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов Desulfovibrio sp. OI и Desulfosporosinus sp. OL в присутствии ионов металлов позволили выявить устойчивость к высоким концентрациям ионам меди, никеля, кобальта и кадмия в условиях низких значений рН (4,0) и определить предельные для роста концентрации. Штаммы Desulfovibrio sp. OI и Desulfosporosinus sp. OL были способны расти при концентрациях в среде (мг/л) Cu2+ 100 и 300, Ni2+ — 150 и 300, Co2+ 150 и 150, Cd2+ 10 и 15, соответственно.

5.  Была проверена устойчивость выделенных штаммов к окислительному стрессу. Выделенные штаммы Desulfovibrio sp. OI и Desulfovibrio sp. O1 были способны к слабому росту на агаризованной питательной среде Постгейта С в условиях аэробиоза и поэтому могут считаться аэротолератными. Были проведены микробиологические и биохимические эксперименты по определению степени влияния кислорода и пероксида водорода (как продукта неполного восстановления О2 в клетках) на рост и процесс сульфатредукции, а также по измерению активностей основных ферментов антиокислительной защиты (каталазы, пероксидазы, супероксиддисмутазы/супероксидредуктазы), обуславливающих относительную аэротолерантность СРБ. Было установлено, что штаммы Desulfovibrio sp. OI и Desulfovibrio sp. O1 были активны при концентрации O2 в газовой фазе до 3 и 5%, при концентрации H2O2 до 0,1 и 0,5 мМ, соответственно. Биохимические исследования показали наличие у исследованных штаммов Desulfovibrio sp. OI и Desulfovibrio sp. O1 супероксиддисмутазы, каталазы, пероксидазы и супероксиддисмутазы и каталазы, соответственно.

6.  Было изучено образование сульфидных минералов СРБ. Для изучения процесса образования нерастворимых сульфидов штаммами OI и OL культивирование проводили на среде с лактатом при добавлении к основной среде раствора ионов никеля и кобальта в концентрации 200 мг/л  при рН 4,5 и 3,5, соответственно. Было обнаружено, что в процессе сульфатредукции образуются такие минералы как лепидокрокит (FeO(OH)), вивианит (Fe3(PO4)2×8H2O), кристаллическая сера (S8), кобальтпентландит (Co9S8), пентландит (Fe6Ni3S8).    .

7. В соответствии с ТЗ, предусматривающем депонирование выделенных в ходе ПНИ штаммов СРБ были подготовлена заявка на депонирование штамма Desulfosporosinus sp. OL1 и штамма Desolfovibrio sp. OI1 во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (ИБФМ). К заявке на депонирование были составлены  паспорта депонируемых штаммов, в которых были приведены сведения о физиологических свойствах штамма, условиях культивирования и таксономическом положении. В коллекции штаммам были присвоены регистрационные номера ВКМ В-3021 D (Desulfosporosinus sp. OL1) и ВКМ В-3020 D (Desolfovibrio sp. OI1). Заявки на депонирование и паспорт штамма представлены в виде отдельных документов к отчету.

8. Были провдены эксперименты по культивированию штамма Desulfovibrio sp. OI в непрерывном проточном режиме, и выявлены наибольшие значения ростовых параметров при значениях рН 5,0-5,3. Снижение рН в условиях биореактора ниже 5,0 ингибировало рост культуры, хотя в режиме периодического культивирования наблюдали хороший рост культуры при рН ниже 5,0 вплоть до 3,5. Эксперименты по оптимизации условий культивирования в биореакторе при низких значениях рН будут продолжены на последующих этапах выполнения работ.

9. Были проведены дополнительные патентные исследования и подготовка заявки на получение патента. Проведенные патентные исследования позволили выявить ближайшие аналоги полученных в ходе выполнения ПНИ  результатов и сформулировать объект правовой защиты – заявку на изобретение «Ацидофильный штамм Desulfosporosinus sp. OL для очистки загрязненных экосистем с экстремально кислыми значениями рH».

Результаты, полученные во втором полугодии 2015 г., будут использованы на дальнейших этапах работ.

Все задачи, поставленные на второе полугодие 2015 года, выполнены полностью.

Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.

V

В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от 7 августа 2014г № 14.604.21.0108 с Минобрнауки России в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014- 2020 годы» на этапе № 4 в период с 1 января 2016г. по 30 июня 2016г.

При этом были получены следующие результаты:

Все штаммы СРБ, устойчивые к низким значениям рН и высоким концентрациям металлов, выделены из осадков, загрязненных тяжелыми металлами из отходов металлургических производств. Поэтому исследование микробных сообществ кислых сточных вод хранилищ отходов металлургии, в том числе с помощью современных геномных и метагеномных подходов, может привести к обнаружению штаммов СРБ с требуемыми свойствами. Использование таких штаммов в биотехнологиях очистки может позволить разработать более простую и дешевую по сравнению с используемыми технологическими схемами активной биологической очистки сточных вод. Повышение рентабельности такой технологической схемы возможно благодаря возможности исключить этапы предварительной водоподготовки или разделения процессов сульфидогенеза и осаждения металлов.

Поскольку единичные известные штаммы СРБ, устойчивые к низким значениям рН и высоким концентрациям металлов, выделены из осадков, загрязненных тяжелыми металлами из отходов металлургических производств, представляется необходимым расширить исследование микробных сообществ кислых сточных вод хранилищ отходов металлургии, в том числе с помощью современных геномных и метагеномных подходов. Целенаправленный поиск и расширение знаний о функциональном биоразнообразии штаммов ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов, позволит вплотную подойти к разработке простой и дешевой технологической осаждения металлов в процессе сульфидогенеза. Одним из направлений развития методической базы проведения таких исследований может стать разработка новых методов выделение ДНК и подготовки проб кислых стоков для выделения ДНК, т.к. именно эффективное выделение нуклеиновых кислот является необходимым условием для проведения молекулярно-биологических исследований.

На четвертом этапе согласно плану-графику были выполнены следующие работы:
1. Выбор наиболее активных штаммов среди выделенных ацидофильных микроорганизмов и выделение клеточной ДНК.
Для проведения анализа полного генома были выбраны выделенные из кислых отходов добычи металлов чистые культуры СРБ Desulfosporosinus sp. I2 и Desulfosporosinus sp. OL, характеризующиеся наиболее высокой устойчивостью к меди и ацидофильным ростом.
Чистота культур полученных новых штаммов ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов, выбранных для геномного анализа, была подтверждена современными методами генетического, биохимического и микроскопического анализов, что соответствует п. 4.2.3 ТЗ.
Выбранные штаммы восстанавливают сульфат с образованием сероводорода при начальном рН среды 2,5, устойчивы к концентрациям кислорода в газовой фазе не менее 0,02 % и обладают устойчивостью к ионам меди, никеля, кобальта и кадмия в повышенных концентрациях, суммарно превышающих 500 мг/л, что соответствует п. 4.2.2 ТЗ. Характеристика устойчивости новых штаммов ацидофильных сульфидогенных микрооорганизмов к суммарной концентрации металлов не менее 500 мг/л и начальной рН среды не выше 2.5 подтверждена в серии экспериментов, включающей не менее 5 субкультивирований, что соответствует пп. 4.2.2 и 4.2.5 ТЗ.
ДНК штаммов I2 и OL была выделена с помощью лизиса с SDS и протеиназой К и экстракцией смесью фенол : хлороформ. Полученного количества ДНК достаточно для проведения полногеномного секвенирования (минимально необходимое количество – 1 мкг).

2. Секвенирование и анализ полных геномов биотехнологически перспективных штаммов ацидофильных сульфидогенных микрорганизмов.
В результате пиросеквенирования и сборки драфт-генома Desulfosporosinus sp. I2  получено 318 контигов длиной более 500 п.о. с размером контига N50 в 30483 п.о.  Аннотация последовательности генома показала 5512 потенциальных белок-кодирующих генов, из которых 3987 (72 %) могут быть функционально значимыми. Геном аннотирован в базу данных референсных последовательностей (RefSeq) NCBI под номером NZ_JYNH00000000.1.
В результате пиросеквенирования и сборки генома Desulfosporosinus sp. OL  получено 290 контигов длиной более 500 нт. Размер генома, оцененный как общая длина всех контигов, составляет около 4.9 млн. нт. Были определены оперон 16S-23S-5S рРНК и 47 генов тРНК, кодирующих все 20 аминокислот. Аннотация последовательности генома выявили 5871 потенциальных белок-кодирующих генов, для 3934 (67 %) из которых  могут быть предсказаны функции. Проект по секвенированию генома штамма Desulfosporosinus sp. OL зарегистрирован в базе данных NCBI под номером PRJNA338386.
Таким образом, в соответствии с п. 3.8 ТЗ определены нуклеотидные последовательности геномов новых двух штаммов ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов — Desulfosporosinus sp. I2 и Desulfosporosinus sp. OL. Полученный геном Desulfosporosinus sp. I2 состоит из 318 контигов длиной более 500 п.о., с общей длиной 5311733 п.о.  Размер генома, оцененный как общая длина всех контигов, составляет около 5,31 Мбит, а содержание GC-пар в геноме — 42,4 %. Были определены пять копий оперона 16S-23S-5S рРНК и 43 гена тРНК, кодирующих все 20 аминокислот. Аннотация последовательности генома показала 5512 потенциальных белок-кодирующих генов, для 3987 (72 %) из которых  могут быть предсказаны функции.

3. Поиск в геноме генетических кластеров, ответственных за устойчивость выделенных штаммов ацидофильных сульфидогенных микрорганизмов к высоким концентрациям солей металлов (Сu, Zn), низким значениям рН, а также окислительному стрессу.
В аннотированном геноме ацидофильной устойчивой к высоким концентрациям СРБ Desulfosporosinus sp. I2 проведен поиск генетических кластеров, ответственных за устойчивость штамма к высоким концентрациям солей металлов, низким значениям рН, а также окислительному стрессу. Устойчивость к металлам обусловлена присутствием в геноме АТФаз П-типа (транспортирующих Cu2+ и Ag2+, а также Zn2+, Cd2+, и Pb2+),  RND (Resistance-Nodulation-Division) транспортеров и белков семейства CDF (cation diffusion facilitators), участвующих в диффузии катионов. Обнаруженные в геноме штамма I2 системы детоксикации кислорода представлены генами супероксиддисмутазы и каталазы, а также окисдоредуктазы. Устойчивость к низким рН связана с присутствием в геноме K+-транспортирующих белков KtrB и TrkA, а также протон-потребляющих декарбоксилаз, таких как аргинин декарбоксилаза Adia и лизин декарбоксилаза CadA.

4. Проведение химического анализа биогенного осадка, образованного в процессе культивирования штаммов сульфидогенных микроорганизмов.
В ходе проведенных работ по культивированию штамма I2 с добавлением ионов меди в концентрации 100 мг/л получены биогенные осадки разных сроков культивирования (16, 28 и 77 сут.). Проведенный элементный и минералогический анализ показал присутствие на всех сроках культивирования, начиная с 16 сут кристаллических фаз сульфидов меди, таких как ковеллин и халькопирит. Трансмиссионная электронная микроскопия ультратонких срезов клеток показала присутствие микрочастиц сульфидов на поверхности клеточной стенки через 16 суток культивирования. При более продолжительных сроках культивирования наблюдали скопления свободных микрочастиц.

5. Проведение дополнительных патентных исследований и подготовка заявки на получение патента.
Проведенные патентные исследования позволили выявить ближайшие аналоги и сформулировать объект правовой защиты – заявку на изобретение «СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ШАХТНЫХ ВОД ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК». В ходе проведения работ экспериментальных исследований, предусмотренных ТЗ, и проведения патентных исследований было показано, что данный способ позволяет провести подготовку проб для последующего эффективного выделения ДНК из проб кислых сточных вод и осадков для проведения молекулярно-биологических исследовании для выявления штаммов перспективных для использования в различных биотехнологических процессах.
Согласно плану-графику исполнения обязательств, на четвертом этапе ПНИ Индустриальным партнером должны были быть проведены следующие работы «Проведение маркетинговых исследований с целью изучения перспектив коммерциализации РИД» и «Разработка лабораторного технологического регламента извлечения сульфидов металлов (Сu, Zn) с помощью новых штаммов ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов».

В связи со сменой Индустриального партнера данные работы будут выполнены на 5 этапе в полном объеме. Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.

V

В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от 7 августа 2014 № 14.604.21.0108 с Минобрнауки России в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014- 2020 годы» на этапе № 5 в период с 1 июля 2016г. по 31 декабря 2016 г.

На пятом этапе согласно плану-графику были выполнены следующие работы и получены следующие результаты:

5.1. Исследования по извлечению сульфидов металлов (Сu, Zn) из отходов горнодобывающей промышленности с помощью новых штаммов ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов.
Были проведены исследования по извлечению сульфидов металлов (Cu, Zn) из отходов горнодобывающей промышленности с помощью бинарной культуры сульфидогенных  штаммов Desulfosporosinus sp. OL и Desulfovibrio sp. OI, устойчивых к низким рН среды и высоким концентрациям растворенных металлов. Эксперимент проведен с использованием биореактора, где проходило культивирование штаммов и куда в полупериодическом режиме поступали жидкие отходы хвостохранилища (рН 2,2), содержащие растворенные металлы, включая медь (не менее 200 мг/л) и цинк (не менее 200 мг/л). Собранный нерастворимый осадок, образовавшийся в ходе культивирования в течение 14 суток с поступлением в проток содержащей металлы жидких отходов хвостохранилища, содержал кристаллические фазы сульфидов меди, таких как ярровит (Cu9S8) и орикит ((CuFeS2)xH2O

5.2. Обобщение результатов исследований.
Обобщение результатов исследований показало, что выполненные работы и их результаты соответствовали заявленным  целям и задачам ПНИ.

5.3. Сопоставление теоретических и экспериментальных исследований.
Сопоставление теоретических и экспериментальных исследований показало, что сделанные на основании теоретических исследований обоснование и выбор направления исследований позволили достичь необходимых для достижения целей ПНИ результатов. Выделение СРБ из осадков хвостохранилищ позволило выделить штаммы СРБ с требуемыми свойствами и провести технологические исследования по осаждению сульфидов металлов из отходов горнодобывающей промышленности (кислых сточных вод) с помощью новых штаммов ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов.

5.4. Оценка полученных результатов в сравнении с современным научно-техническим уровнем
Оценка полученных в ходе выполнения ПНИ результатов в сравнении с современным научно-техническим уровнем показало, что полученные результаты могут быть использованы для усовершенствования существующих технологических схем активной очистки кислых сточных вод от сульфатов и ионов тяжелых металлов.

5.5. Разработка технических требований использования микробиологической технологии одностадийного извлечения металлов.
Разработанные технические требования распространяются на микробиологические технологии одностадийного извлечения металлов, предназначенные для извлечения металлов из сточных вод отходов цветной металлургии в виде сульфидов, образующихся в процессе роста штаммов ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов. Разработанные технические требования включают разделы «Предисловие»,  «Область применения», «Нормативные ссылки», «Термины и определения», «Основные технические требования», «Требования к используемым штаммам». Разработанные технические требования представлены в виде отдельного документа (приложения к отчету).

5.6. Разработка проекта ТЗ на проведение ОТР.
В соответствии с Техническим заданием и План-графиком на заключительном этапе по результатам выполненного проекта запланирована разработка Технического задания на проведение опытно-технологической работы (ОТР) по теме «Разработка технологии одностадийного образования сульфидов металлов с использованием сульфидогенных микроорганизмов».

5.7. Материально-техническое обеспечение работ.

5.8. Адаптация новых штаммов ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов для непрерывного культивирования в условиях опытно-промышленных установок.
Проведенные работы адаптация новых штаммов ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов для непрерывного культивирования в условиях опытно-промышленных установок показали, что бинарная культура, состоящая из выделенных в ходе выполнения ПНИ штаммы ацидофильных СРБ (Desulfosporosinus sp.OL и Desulfovibrio sp. OI,) могут быть успешно адаптированы для культивирования в условиях биореактора.

Кроме того, были выполнены работы, перенесенные на 4 этапа на 5 в связи со сменой Индустриального партнера:
4.6. Проведение маркетинговых исследований с целью изучения перспектив коммерциализации РИД.
Были проведены маркетинговые исследования с целью определения востребованности результатов ПНИ потенциальными потребителями на территории России и возможности их коммерциализации. Был проведен сравнительный анализ технологий очистки рудничных вод от сульфатов и металлов, сведений о мировом опыте внедрения данных технологий. Проведен анализ объемов инвестиций компаний ГМК России и государственного бюджета РФ в охрану окружающей среды. Было установлено, что технологии активной биологической очистки кислых стоков от сульфатов и тяжелых металлов с использованием результатов ПНИ могут быть востребованы предприятиями ГМК России.

4.7. Разработка лабораторного технологического регламента извлечения сульфидов металлов (Сu, Zn) с помощью новых штаммов ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов. Разработанный технологический регламент предусматривает получение сульфидов металлов с помощью штаммов, выделенных в процессе выполнения ПНИ в режиме проточного культивирования.

Таким образом, обобщение результатов исследований, сопоставление теоретических и экспериментальных исследований, а также  оценка полученных результатов в сравнении с современным научно-техническим уровнем позволили сделать вывод, что полученные в ходе выполнения ПНИ результаты соответствуют заявленным целям  и могут быть использованы для разработки биотехнологического метода извлечения металлов из отходов горнодобывающей промышленности на основе новых штаммов ацидофильных сульфидогенных микроорганизмов. Выделенные штаммы СРБ обладали высокой устойчивостью к ионам тяжелых металлов, были активны при низких рН среды и были способны осуществлять осаждение ионов металлов в условиях культивирования в биореакторе. На основании полученных результатов был разработан проект ТЗ на проведение ОТР по теме: «Разработка технологии одностадийного образования сульфидов металлов с использованием сульфидогенных микроорганизмов».

Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.


Проект: Разработка биотехнологического процесса окисления аммония микроорганизмами в бескислородных условиях для очистки сточных вод
Номер проекта: № 14.607.21.0018
Мероприятие ФЦП: 1.3
Руководитель работ: Пименов Николай Викторович
Сроки выполнения: 2014-2016 гг.
Общий объем бюджетного и привлеченного финансирования: 90 млн. руб.

V

Цель проекта — разработка основ высокоэффективной технологии микробиологической очистки сточных вод на основе процесса аноксидного окисления аммония активным илом анаммокс

V

1) подготовлен аналитический обзор литературы и патентных исследований, свидетельствующий о том, что технология аноксидного окисления аммония, осуществляемая специфической группой бактерий – планктомицетов, имеет несомненные перспективы для реализации крупнотоннажного процесса Анаммокс на очистных сооружениях г. Москвы и других крупных городах РФ.

2) На примере монокультур анаммокс бактерий, имеющихся в ИНМИ РАН, а также микробных сообществ из осадочных отложений действующих очистных сооружений г. Москвы проведена отработка методов для анализа консорциума микроорганизмов, осуществляющих процесс Анаммокс.

3) С помощью параллельного пиросеквенирования фрагментов генов 16S РНК проведен молекулярный анализ 6 образцов консорциума микроорганизмов из очистных сооружений, соответствующих трем последовательным этапам селекции.

4) Определены динамика изменения соотношения основных групп микроорганизмов по мере «созревания» ила, а также их распределение между нитрифицирующей и анаммокс фракциями. Среди нитрифицирующих бактерий обнаружены представители Nitrospira и протеобактерий.

5) Разработана техническая документация на однореакторную лабораторную установки анаммокс и проводится закупка необходимого оборудования для ее монтажа.

V

В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от 5 июня 2014 № 14.607.21.0018 с Минобрнауки России в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014- 2020 годы» на этапе № 2 в период с 30 января 2015г. по 30 июня 2015г.

Выполнялись следующие работы:
1 Запуск однореакторной лабораторной установки анаммокс.
2 Подбор условий и параметров культивирования активного ила анаммокс в однореакторной лабораторной установке анаммокс.
3 Наработка экспериментального образца активного ила анаммокс.
4 Разработка программы и методик исследовательских испытаний экспериментального образца активного ила анаммокс.
5 Определение состава микробного консорциума экспериментального образца активного ила анаммокс молекулярными методами.
6 Разработка программы и методик исследовательских испытаний однореакторной лабораторной установки анаммокс.
7 Разработка инструкции по эксплуатации однореакторной лабораторной установки анаммокс.
8 Разработка технической документации на однореакторную пилотную установку анаммокс.
9 Материально-техническое обеспечение работ по запуску пилотной установки анаммокс.
10 Контроль за эффективностью работы однореакторной лабораторной установки анамммокс по удалению азота из сточных вод.

При этом были получены следующие результаты:
Разработана техническая документация на однореакторную лабораторную установку анаммокс, состоящую из пояснительной записки, чертежа общего вида, маршрутных карт и технологической схемы. Разработана инструкция по эксплуатации однореакторной лабораторной установки анаммокс. Осуществлен монтаж, сборка и запуск на территории АО «Мосводоканал» однореакторной лабораторной установки анаммокс, очищающей не менее 100 л сточных вод в сутки.   Для инокуляции был использован ил из ферментера анаммокс, работавшего при температуре 30оС. В результате подбора оптимальных условий и параметров культивирования активного ила анаммокс в однореакторной лабораторной установке анаммокс был наработан экспериментальный образец активного ила анаммокс для дальнейших исследовательских испытаний.  Разработана техническая документация на однореакторную пилотную установку анаммокс, состоящая из пояснительной записки, чертежа общего вида, маршрутных карт и технологической схемы.

Полученные характеристики научной продукции, свойств активного ила анаммокс и лабораторной установки анаммокс, подтверждают правильность выбранного пути создания первой российской импортозамещающей технологии очистки сточных вод от аммония Анаммокс. Успешно осуществлена инокуляция активного ила анаммокс и его наращивание. Технология отличается от зарубежных аналогов новизной технических решений – использованием прикрепленной загрузки (за рубежом используются в основном технологии на основе свободного ила и плавающих загрузок), а также простотой алгоритма управления. Микроорганизмы, ведущие процесс анаммокс в установке Jettenia moscovienalis, впервые выделены, т.е. не встречаются нигде более в мире, что открывает перспективы патентования. Полученные результаты полностью соответствуют требованиям технического задания.

Результаты, полученные в первом полугодии 2015 г., будут использованы на дальнейших этапах работ.

Все задачи, поставленные на первое полугодие 2015 года, выполнены полностью.

Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.

V

В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от 5 июня 2014 № 14.607.21.0018 с Минобрнауки России в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014- 2020 годы» на этапе № 3 в период с 1 июля 2015г. по 31 декабря 2015г.

Выполнялись следующие работы:
3.1 Проведение исследовательских испытаний экспериментального образца активного ила анаммокс, наработанного в однореакторной лабораторной установке анамокс
3.2 Метагеномный анализ консорциума микроорганизмов экспериментального образца активного ила анаммокс
3.3 Сборка и запуск пилотной однореакторной установки анаммокс.
3.4 Разработка Программы и методик исследовательских испытаний однореакторной пилотной установки анаммокс
3.5 Проведение исследовательских испытаний однореакторной лабораторной установки анаммокс.
3.6 Материально-техническое обеспечение работ по обслуживанию однореакторной лабораторной и пилотной установок анаммокс.
3.7 Контроль за эффективностью работы однореакторной лабораторной и пилотной установок анамммокс по удалению азота из сточных вод.
3.8 Разработка инструкции по эксплуатации однореакторной пилотной установки анаммокс.

При этом были получены следующие результаты:
Успешно проведены исследовательские испытания экспериментального образца активного ила анаммокс, наработанного в однореакторной лабораторной установке анаммокс по всем пунктам Программы и методикам исследовательских испытаний. В однореакторной лабораторной установке постоянно присутствуют в физиологически активном состоянии как минимум два вида анаммокс-бактерий Ca. “Brocadia” sp. и Ca. “Jettenia moscovienalis”, процентное соотношение которых изменяется в ответ на изменения внешних условий. Суммарная численность физиологически активных нитрификаторов II группы была низкой (менее 1.5% от общей численности эубактерий). Вклад нитрификаторов I группы составлял 30-35% от общей численности эубактерий, что коррелировало с численностью анаммокс-бактерий и обеспечивало высокую эффективность удаления аммония в лабораторной установке. После увеличения содержания аммонийного азота в поступающем на очистку фильтрате и оптимизации параметров работы лабораторной установки эффективность удаления азота достигла 80%. Температурный оптимум роста микробного сообщества, осуществляющего эффективное удаление аммонийного азота, лежит в диапазоне температур 25-37оС. Оптимальный рН роста микробного сообщества лежит в диапазоне рН 6.5 – 8.5.

В результате анализа метагеномных данных было установлено, что в активном иле анаммокс формируется сложное сбалансированное микробное сообщество, в котором доминирующим микроорганизмом является ранее не описанная бактерия рода Ca “Brocadia”, близкородственная Ca. “Brocadia caroliniensis” (98% сходства последовательностей гена 16S рРНК).

В соответствии с пп. 2.6, 3.17, 4.1.4, 4.1.5, 4.1.6, 4.2 ТЗ на третьем этапе выполнения ПНИ была собрана и запущена пилотная однореакторная установка анаммокс.

Объект испытания однореакторная лабораторная установка анаммокс выдержал испытание по пунктам № 4.1-4.7 и 6.1-6.7 Программы и методики исследовательских испытаний однореакторной лабораторной установки анаммокс (ИИ 14.607.21.0018 ЛУА). Объект испытания однореакторная лабораторная установка анаммокс, соответствует техническим требованиям пунктов № 4.1.1-4.1.3 ТЗ.

Результаты, полученные в первом полугодии 2015 г., будут использованы на дальнейших этапах работ.

Все задачи, поставленные на первое полугодие 2015 года, выполнены полностью.

Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.

V

В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от 5 июня 2014г № 14.607.21.0018 с Минобрнауки России в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014- 2020 годы» на этапе № 4 в период с 1 января 2016г. по 30 декабря 2016г.

Выполнялись следующие работы:
4.1 Микробиологический и физиолого-биохимический контроль изменения активности микроорганизмов экспериментального образца активного ила анаммокс.
4.2 Молекулярный анализ стабильности состава консорциума экспериментального образца активного активного ила в ходе биотехнологического процесса.
4.3 Наработка в пилотной установке экспериментального образца активного ила анаммокс для инокуляции промышленного биореактора.
4.4 Проведение исследовательских испытаний однореакторной пилотной установки анаммокс.
4.5 Материально-техническое обеспечение работ по обслуживанию однореакторной пилотной установки анаммокс.
4.6 Контроль количества и качества экспериментального образца активного ила анаммокс в однореакторной пилотной установке анаммокс.
При этом были получены следующие результаты:
1 Осуществлен микробиологический и физиолого-биохимический контроль изменения активности микроорганизмов экспериментального образца АИ анаммокс, в результате которого показано, что скорость роста анаммокс-бактерий в экспериментальном образце АИ пилотной установки составляет 0.11 сут-1, что соответствует времени удвоения менее 10 сут, и выше запланированного показателя (20-30 сут). Выращенный в пилотной установке АИ анаммокс гетерогенен по составу анаммокс-популяции и демонстрирует чрезвычайно высокую устойчивость к повышенным концентрациям нитритов (100-300 мг/л). В разные периоды работы установки в АИ присутствуют в физиологически активном состоянии как минимум три морфотипа анаммокс-бактерий с разным отношением к нитриту: растущие при концентрациях нитрита 130 мг/л и ниже, растущие в широком диапазоне концентраций нитритов (130-300 мг/л), но предпочитающие более низкие концентрации и 3) растущие при высоких концентрациях нитрита (300 мг/л).

2 Проведен молекулярный анализ стабильности состава консорциума экспериментального образца АИ анаммокс в ходе биотехнологического процесса, в результате которого показано, что таксономическое разнообразие бактерий увеличивается в ходе технологического процесса при общем снижении вклада филумов, доминировавших ранее в лабораторной установке и попавших в пилотную установку с инокулятом. Данная тенденция прослеживается и по отношению к целевому порядку Planctomycetes. Напротив, разнообразие архей в АИ пилотной установки снижается по сравнению с инокулятом, но сохраняется доминирование ацетокластических метаногенов. В ходе технологического процесса в АИ пилотной установки снизился общий вклад планктомицетов по сравнению с инокулятом за счет снижения доли анаммокс-бактерий. Возможной причиной этого является возрастание содержания нитритов в реакторе. Данные, полученные с помощью метода пиросеквенирования, согласуются с результатами физиолого-биохимического и микроскопического контроля АИ и позволяют с высокой долей вероятности утверждать, что анаммокс-бактерии Ca. “Brocadia” sp. обладают важным технологическим свойством – активностью при высоких концентрациях нитрита (более 250 мг N/л), а Ca. “Anammoxoglobus” — при низких.

3 В пилотной установке наработан экспериментальный образец АИ анаммокс для инокуляции промышленного биореактора в количестве 1 шт. массой 20 кг (объем АИ — 2 м3, доза ила — 10 кг/м3). Комиссией установлено, что объект испытаний пригоден для инокуляции промышленного биореактора.

4 Проведены исследовательские испытания однореакторной пилотной установки анаммокс по ранее разработанным Программе и методикам, в результате которых выявлены основные показатели работы однореакторной пилотной установки анаммокс: мощность по расходу фильтрата – 10-20 м3/сут, мощность по удалению азота — 2-3 кг азота в сутки, эффективность удаления азота – до 90%. Таким образом, требования ТЗ к объекту испытаний — однореакторной пилотной установке анаммокс — выполнены в полном объеме, объект испытаний и техническая документация на объект испытаний в техническом и патентно-правовом аспекте соответствует заданным в техническом задании требованиям, перечисленным в Программе и методиках.

5 Из средств Индустриального партнера АО «Мосводоканал» были выполнены в полном объеме заявленные в плане-графике работы: материально-техническое обеспечение работ по обслуживанию однореакторной пилотной установки анаммокс и контроль количества и качества экспериментального образца активного ила анаммокс в однореакторной пилотной установке анаммокс. Кроме того, было профинансировано участие в конгрессе Экватек-2016.

6 Осуществлен контроль количества и качества экспериментального образца активного ила анаммокс в однореактоной пилотной установке анаммокс, в результате которого показано, что к концу отчетного периода (конец июня 2016 г) был успешно завершен период технологической пуско-наладки, отлажено все технологическое оборудование (емкостное оборудование, трубопроводы, механическое оборудование, электрооборудование, система автоматизации, сбора и обработки данных), установка вышла на запланированную мощность по расходу фильтрата и удалению азота. Об адаптации биоценоза АИ (прикрепленного и свободноплавающего) к условиям установки свидетельствует возрастание количества (массы) ила, начавшееся спустя 2-2,5 мес с момента инокуляции пилотной установки. Подтверждена возможность использования электропроводности среды для контроля как эффективности удаления азота в ходе работы установки, так и для расчетов концентрации аммония в поступающем фильтрате и в очищенной воде.

На четвертом этапе выполнения ПНИ написаны и сданы в печать две экспериментальные статьи по результатам экспериментальных испытаний однореакторной лабораторной установки анаммокс, полученным на 3 этапе выполнения ПНИ:
1.   Марданов А.В., Белецкий А.В., Каллистова А.Ю., Котляров Р.Ю, Николаев Ю.А., Кевбрина М.В., Агарев А.М., Равин Н.В., Пименов Н.В. Динамика изменения состава микробного консорциума в процессе запуска однореакторной проточной лабораторной установки нитритации/анаммокс // Микробиология. 2016. Принята к печати и будет опубликована в №6 журнала.
2.   А.Г. Дорофеев, Ю.А. Николаев, М.Н. Козлов, М.В. Кевбрина, А.М. Агарев, А.Ю. Каллистова, Н.В. Пименов. Математическое моделирование процесса анаммокс с использованием пакета прикладных программ BioWin // Прикладная биохимия и микробиология. Сдана в печать 23.05.16.

Результаты работы были представлены на конгрессе Экватек-2016, проходившем в Москве с 26 по 28 апреля 2016 г. в виде устного доклада и статьи, опубликованной в материалах конгресса:
1. Козлов М.Н., Кевбрина М.В., Николаев Ю.А., Дорофеев А.Г., Асеева В.Г., Грачев В.А., Жарков А.В., Пименов Н.В. Развитие технологии аноксидного окисления аммония для очистки сточных вод в АО «Мосводоканал».
Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.

V

В ходе выполнения проекта по Соглашению о предоставлении субсидии от 5 июня 2014 № 14.607.21.0018 с Минобрнауки России в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014- 2020 годы» на этапе № 5 в период с 1 июля 2016г. по 31 декабря 2016г.

В результате проведения работ по пятому этапу ПНИ выполнены все пункты календарного плана:

1. Произведена оптимизация параметров экспериментального образца активного ила анаммокс для инокуляции промышленного биореактора, в результате которой получен активный ил, содержащий уникальный консорциум анаммокс-бактерий, который не только полностью соответствует параметрам п. 4.1.8 ТЗ, но и содержит новые организмы: анаммокс-бактерий, устойчивых к высоким концентрациям нитритов и низким значениям рН, и термотолерантных бактерий-нитрификаторов первой группы Высокая скорость роста анаммокс-бактерий позволяет усовершенствовать технологию за счет накопления биомассы анаммокс-бактерий в свободноплавающем иле. В пилотной установке накоплено. В пилотной установке анаммокс наработано 277 кг экспериментального образца активного ила анаммокс для инокуляции промышленного биореактора.

2. Проведено технико-экономическое обоснование применения технологии анаммокс на ЛОС, которое подтверждает перспективность внедрения технологии Анаммокс на ЛОС и других очистных сооружениях: экономический эффект от внедрения технологии Анаммокс на ЛОС составит 120 млн. рублей в год, капитальные затраты для строительства цеха Анаммокс для очистки фильтрата декантеров составят 553 млн. руб, срок окупаемости — 4.6 года.

3. Разработано ТЗ на проведение ОТР по теме «Разработка технологии аноксидного окисления анаммокс на Люберецких очистных сооружениях».

4. Разработаны рекомендации по эксплуатации промышленного реактора анаммокс на Люберецких очистных сооружениях.

5 Из средств Индустриального партнера АО «Мосводоканал» были выполнены в полном объеме заявленные в плане-графике работы: материально-техническое обеспечение работ по разработке рекомендаций по эксплуатации промышленного реактора анаммокс на ЛОС, по обслуживанию однореакторной пилотной установки анаммокс и контролю количества и качества экспериментального образца активного ила анаммокс, по разработке задания на проектирование промышленного биореактора анаммокс на ЛОС.

6. Разработано задание на проектирование промышленного биореактора анаммокс на ЛОС.

На пятом этапе выполнения ПНИ опубликована статья, индексируемая в WoS и Scopus:
Марданов А.В., Белецкий А.В., Каллистова А.Ю., Котляров Р.Ю., Николаев Ю.А., Кевбрина М.В., Агарев А.М., Равин Н.В., Пименов Н.В. Динамика изменения состава микробного консорциума в процессе запуска однореакторной проточной лабораторной установки нитритации/анаммокс // Микробиология. 2016. Т. 85. №6. C. 663-675.

Принята к печати и будет опубликована в январе 2017 г статья:
Дорофеев А.Г., Николаев Ю.А., Козлов М.Н., Кевбрина М.В., Агарев А.М., Каллистова А.Ю., Пименов Н.В. Моделирование процесса анаммокс с использованием пакета прикладных программ BioWin // Прикладная биохимия и микробиология. 2017, Т. 53. №1, Сдана в редакцию 19.05.2016 г.

Результаты работы были представлены в виде устных докладов на:
1. Международной научно-практической конференции «Водный форум БРИКС», Россия, Москва, 29-30 сентября 2016 г.,

2. V Съезде биохимиков России, Сочи, Россия, 4-8 октября 2016 г.,

3. III ежегодной Всероссийской Научно-практической конференции «Исследования и разработки — 2016», Россия, Москва, 14-15 декабря 2016 г.

По результатам работы получен патент РФ на изобретение № 2605325 (решение о выдаче патента от 28.10.2016 г.) по заявке № 2015142067 «Способ очистки сточных вод от аммония и органического вещества», авторы: Козлов М.Н., Гаврилин А.М., Кевбрина М.В., Николаев Ю.А., Дорофеев А.Г., Пименов Н.В., Агарев А.М., Каллистова А.Ю., патентообладатель — ФИЦ Биотехнологии РАН.

Подана заявка на изобретение «Способ очистки сточных вод от аммония и органического вещества и установка для его осуществления» № 2016144486, авторы: Козлов М.Н., Гаврилин А.М., Кевбрина М.В., Николаев Ю.А., Дорофеев А.Г., Пименов Н.В., Жарков А.В., Агарев А.М., Асеева В.Г., Каллистова А.Ю., дата поступления заявки в ФИПС — 14.11.2016, патентообладатель — ФИЦ Биотехнологии РАН.

Задачи, поставленные в календарном плане по пятому этапу выполнения работ в рамках Соглашения № 14.607.21.0018 от «5» июня 2014 г. выполнены в полном объеме.
Комиссия Минобрнауки России признала обязательства по Соглашению на отчетном этапе исполненными надлежащим образом.


Проект: Разработка методов получения иммунобиологических препаратов на основе протективного антигена Bacillus anthracis в составе гибридных частиц бактериофагов
Номер проекта: № 607.21.0093
Мероприятие ФЦП: 1.3
Руководитель работ: Летаров Андрей Викторович
Сроки выполнения: 2014-2016 гг.
Индустриальный партнер: Федеральное казенное предприятие «Орловская биофабрика»
Общий объем бюджетного и привлеченного финансирования: 27,3 млн. руб.

V

Целью проекта является разработка метода повышения иммуногенности антигенов, получаемых с помощью рекомбинантных технологий, за счет их перевода в форму вирусоподобных частиц. Технология необходима для использования в производстве вакцин. В рамках данного проекта задача решается на модели протективного антигена Bacillus anthracis, лежащего в основе всех существующих вакцин против сибиреязвенной инфекции, и белков бактериофага DT57C.

Назначение и область применения результатов проекта:
В настоящее время существует необходимость в создании вакцины нового поколения против сибирской язвы для крупного рогатого скота и северного оленя, производство которой будет экономически эффективным и безопасным, при этом выработка иммунного ответа будет обеспечивать быстрый протективный иммунитет привитых животных. Разработанные в рамках проекта способы получения иммунобиологических препаратов позволят перейти в дальнейшем к стадии доклинических испытаний.

V

Работа на первом этапе была направлена на выбор решений, лежащих в основе новой технологии промышленного получения вирусоподобных частиц. Технология должна быть экономически оправданной, обладать простотой и высокой технологической устойчивостью, обеспечивать повышение иммуногенности антигена по сравнению с его растворимой формой, сопоставимое с иммуногенностью природных вирусных частиц.

На первом этапе работы были получены результаты:

  1. За счет анализа научных публикаций и патентной литературы выявлены тенденции, характеризующие область объекта разработки: получение вакцин для специфической профилактики сибиреязвенной инфекции у человека и животных, использование вирусоподобных частиц при создании вакцин.
  2. Сконструирован искусственный ген протективного антигена B.anthracis, адаптированный по кодоновому составу для экспрессии в E. coli. С помощью искусственного гена PAG получена экспрессионная конструкция на оcнове вектора pQE
  3. Разработан дизайн экспрессионной конструкции, кодирующей слитой продукт «pb10 DT57 1/2 — PAG» (с использованием протективного декорирующего белка головки бактериофага pb10 DT57 1/2 и протективного антигена B.anthracis).
  4. Создана коллекция бактериофагов для отбора белков, позволяющих наиболее эффективно конструировать на их основе ВПЧ с высокой иммуногенностью и оптимальными технологическими свойствами.

V

Работа по 2 этапу была направлена на cоздание рекомбинантных штаммов-продуцентов модифицированного протективного антигена B. anthracis в форме частиц бактериофагов. Получаемые на данном этапе генно-инженерные конструкции должны обеспечивать продукцию двух интактных бактериофагов и одного химерного белка, включающего полимеризующийся белок бактериофага и целевой антиген в клетках E.coli.

В течение отчетного периода работы были получены следующие наиболее важные результаты:

  1. В результате скрининга созданной на предыдущем этапе коллекции бактериофагов отобраны два новых, патентно-чистых бактериофага, пригодных для использования в целях развития создаваемой технологии в качестве векторов для дисплея антигенов и источников генов полимеризующихся белков.
  2. Созданы экспрессионные плазмидные конструкции, обеспечивающие продукцию в клетках E. coli белка трубки хвоста pb6 и белка, терминирующего хвост p142 бактериофага DT57C под контролем промоторов фага Т7.
  3. Создана экспрессионная плазмидная конструкция, обеспечивающая экспрессию химерного белка, содержащего на N-конце полную последовательность полимеризующегося белка p142, а на С-конце антигена — PA20 Bacillus anthracis, соединенных гибким линкером.
  4. Отработаны условия культивирования полученных продуцентов, обеспечивающие оптимальную экспрессию полученного химерного белка.
  5. Разработана методика количественной оценки уровня накопления слитого протективного антигена в клетках продуцентов.

V

Работа по отчетному периоду была направлена на наработку и очистку иммунобиологического препарата, содержащего протективный антиген B. anthracis в форме вирусоподобных частиц.

Для достижения целей проекта на данном этапе решали следующие исследовательские задачи:
1. Исследование возможности самосборки вирусоподобных частиц из созданного слитого белка «антиген протективного антигена B. anthracis — белок бактериофага.
2. Отработка условий бесколоночной очистки вирусоподобных частиц, содержащих протективный антиген B. anthracis.
3. Отработка условий гель-фильтрации частиц, содержащих протективный антиген B. anthracis.
4. Разработка иммунобиологического препарата на основе вирусоподобных частиц, содержащих протективный антиген B. anthracis и оформление лабораторного регламента его получения.
5. Наработка экспериментальных образцов иммунобиологического препарата на основе вирусоподобных частиц, содержащих протективный антиген B. anthracis.

В течение отчетного периода работы были получены следующие наиболее важные результаты:

  • В результате произведенных исследований возможности самосборки вирусоподобных частиц, установлено, что при экспрессии химерного белка ТТРРА, содержащего протективный антиген anthracis, происходит самопроизвольное формирование сферических вирусоподобных частиц, пригодных для целей настоящего проекта.
  • Подобраны условия и разработан протокол бесколоночной очистки вирусоподобных частиц, содержащих протективный антиген Banthracis.
  • Подобраны условия гель-фильтрации вирусоподобных частиц, содержащих протективный антиген B.anthracis, при которых выход очищенных частиц массой ~20 мДа во фракции свободного объема составляет около 35% от общего белка исходного препарата, то есть, ~3 мг. Объем фракций, содержащих целевой белок составляет 6 мл.
  • Разработан лабораторный регламент получения иммунобиологического препарата на основе вирусоподобных частиц, содержащих протективный антиген B. anthracis.
  • Наработаны экспериментальные образцы иммунобиологического препарата на основе вирусоподобных частиц, содержащих протективный антиген B.anthracis, представляющие собой устойчивый при хранении стерильный апирогенный коллоидный раствор, содержащий 409,2 мг общего белка (не менее 3,4 мг/мл).

Проведены работы по патентованию результатов проекта. Подана заявка на изобретение № 2015146604 от 29.10.2015 г. «ДНК-конструкция, кодирующая модифицированный вариант протективного антигена Bacillus anthracis».

V

В течение 4 этапа работы были получены следующие наиболее важные результаты, удовлетворяющие требованиям Технического задания:

  1. Доказана высокая стабильность и гомогенность ВПЧ, сформированных белком – продуктом конструкции pTTPPA.
  2. Разработаны и испытаны полностью оригинальные тест-системы для оценки величины бласт-трансформации смешанной популяции лейкоцитов мыши. На основе разработаной тест-системы апробирована методика оценки токсиннейтрализующих титров антител.
  3. Показано, что иммунизация мышей протективным антигеном в форме ВПЧ приводит к существенно более интенсивному образованию Т-лимфоцитов специфичных к протективному антигену B. anthracis, чем иммунизация растворимым протективным антигеном в очищенном виде или в форме коммерчески доступной живой вакцины. Уровень продукции токсиннейтрализующих антител при иммунизации животных экспериментальным образцом — протективным антигеном B. anthracis в форме ВПЧ в среднем в два раза выше, чем при иммунизации протективным антигеном в растворимой форме.
  4. Проведено материально-техническое обеспечение выполнения работ этапа за счет внебюджетных средств индустриального партнера ПНИЭР. Затраты были связаны с закупкой реактивов и лабораторных материалов для наработки экспериментальных образцов иммунобиологического препарата на основе вирусоподобных частиц, содержащих протективный антиген B. anthracis.

V

На 5 (заключительном) этапе ПНИЭР:

  1. Исследованы технологически важные характеристики экспериментального образца иммунобиологического препарата протективного антигена B. anthracis в форме вирусоподобных частиц: физико-химические свойства, гомогенность, стойкость при хранении.
  2. Доказана высокая стабильность и гомогенность ВПЧ, сформированных белком – продуктом конструкции pTTPPA. Методом динамического светорассеяния показано, что их размер составляет около 48 нм, который практически не меняется при хранении в течение 1-4 месяцев.
  3. Проведена иммунизация мышей экспериментальным образцом иммунобиологического препарата.
  4. Выполнены исследования иммуногенности экспериментального образца иммунобиологического препарата протективного антигена B. anthracis в форме вирусоподобных частиц in vitro, в том числе, в реакции бласт-трансформации лейкоцитов с оценкой результата с помощью ПЦР в реальном времени.
  5. В тестах in vitro с применением методов оценки скорости бласт-трансформации смешанной культуры лейкоцитов показано, что иммунизация мышей протективным антигеном в форме ВПЧ приводит к существенно более интенсивному образованию Т-лимфоцитов специфичных к протективному антигену B. anthracis, чем иммунизация растворимым протективным антигеном в очищенном виде или в форме коммерчески доступной живой вакцины. Бласт-трансформация В-лимфоцитов в СМЛ животных, иммунизированных протективным антигеном в форме ВПЧ, также идет интенсивнее, чем в случае СМЛ животных, иммунизированных протективным антигеном в растворимой форме.
  6. Выполнены исследования экспериментального образца иммунобиологического препарата протективного антигена B. anthracis в форме вирусоподобных частиц in vivo по уровню продукции токсин-нейтрализующих антител. Показано, что уровень продукции токсин-нейтрализующих антител при иммунизации животных экспериментальным образцом ‒ протективным антигеном B. anthracis в форме ВПЧ в среднем в два раза выше, чем при иммунизации протективным антигеном в растворимой форме.
  7. Подана заявка на патент РФ № 2015146604 от 29.10.2015 г. «ДНК-конструкция, кодирующая модифицированный вариант протективного антигена Bacillus anthracis».

На предшествующих этапах ПНИЭР были получены следующие наиболее важные результаты: Сконструирован искусственный ген протективного антигена В. anthracis, адаптированный по кодоновому составу для экспрессии в Е. coli. С помощью искусственного гена PAG получена экспрессионная конструкция обеспечивающая продукцию протективного антигена В. anthracis в водорастворимой форме.  Получены две серии экспрессионных конструкций рТТРх (белок трубки хвоста Т5-подобного бактериофага DT5C) и рТгР (белок, терминирующий хвост, Т5-подобного бактериофага DT5C) обеспечивающие продукцию в клетках E. coli белков бактериофагов, потенциально пригодных для дисплея антигенов на вирусоподобных частицах. Получены рекоминантные экспрессионные вектора, позволяющие производить наработку вирусоподобных наночастиц, состоящих из белка ТТР и последовательности РАG и PA20. Отработана процедура биосинтеза и очистки этих частиц.

За все время реализации проекта (2014-2016 гг.) опубликовано 4 статьи в рецензируемых научных журналах.


Проект: Обеспечение участия российских ученых в Х Международном конгрессе по Экстремофилам (International congress on Extremophiles)
Номер проекта: № 14.598.11.0009
Мероприятие ФЦП: 3.3.2
Руководитель работ: Бонч-Осмоловская Елизавета Александровна
Сроки выполнения: 2014 г.
Общий объем бюджетного и привлеченного финансирования: 5 млн. руб.

V

ИНМИ РАН и ISE Extremophiles явились организаторами проведения Х Международного конгресса по экстремофилам («Extremophiles-2014», 10th International Congress on Extremophiles; www.extremophiles2014.ru), Санкт-Петербург, 7–11 сентября 2014 г. Председатель оргкомитета конгресса – Бонч-Осмоловская Е.А. На пленарных секциях представили свои доклады-лекции 5 сотрудников ИНМИ РАН. Общее число участников конгресса – 856 чел. из 40 стран (в том числе 33 сотрудника ИНМИ РАН; из них 13 – молодые ученые).


Проект: Разработка экологически безопасной высокоскоростной энергоэффективной технологии утилизации органической фракции бытовых отходов на основе процесса анаэробной микробной ферментации для уменьшения антропогенной нагрузки полигонов твердых бытовых отходов на окружающую среду городских и прилегающих к ним территорий
Номер проекта: № 14.607.21.0024
Мероприятие ФЦП: 1.3
Руководитель работ: д.б.н. Ножевникова Алла Николаевна
Сроки выполнения: 2014-2016 гг.
Индустриальный партнер: АО «Компания «ЭКОС».
Общий объем бюджетного и привлеченного финансирования: 88,5 млн. руб.

V

Проект направлен на создание научно-технологических решений, обеспечивающих разработку экологически безопасной, высокоскоростной, энергоэффективной технологии переработки органической фракции твердых бытовых отходов (ТБО) и осадков сточных вод в метан на основе анаэробной микробной ферментации для уменьшения антропогенной нагрузки полигонов ТБО на окружающую среду. Результаты настоящего проекта найдут широкое применение в таких отраслях, как коммунальное хозяйство городов (очистные сооружения, сбор и утилизация ТБО), компании, занимающиеся утилизацией различных органических отходов, и также предприятия пищевой и перерабатывающей отрасли. В перспективе будет разработана и внедрена технология высокоскоростной анаэробной ко-ферментации органического вещества твердых бытовых отходов (ТБО) и осадков сточных вод (ОСВ) с получением метана и биоудобрений. Полученные результаты позволят:
— вывести на рынок новую научно-техническую продукцию, разработать технологию мирового уровня, разработать  более совершенную микробную технологию обработки ОФ-ТБО;
— заместить импорт и обеспечить экспортный потенциал: импорто-замещение продукции зарубежных компаний, производящих реакторы и системы жидкофазной ферментации ОСВ, а также компаний, производящих системы микробиологической очистки жидкой фракции сброженной массы от азота с применением процесса анаммокс;
— получить значимые научные результаты, позволяющие переходить к созданию новых видов научно-технической продукции;
— создать технологический задел для широкомасштабного применения в России технологии ко-ферментации ОФ-ТБО и ОСВ.

V

Выполнен аналитический обзор научных и информационных источников, затрагивающих научно-техническую проблему, исследуемую в рамках ПНИ, указывающий на ее актуальность.
Проведены патентные исследования, свидетельствующие о новизне предлагаемого подхода.
Обоснован выбор исследований в области применения микроорганизмов для разработки технологических основ утилизации органических загрязнений.
Разработаны лабораторные методики (молекулярные, физиологические и культуральные) анализа ключевых групп микроорганизмов, важных для утилизации органических загрязнений.
Создана базовая математическая динамическая модель превращения органического вещества в биогаз на основе данных научной и технической литературы, которая позволяет с достаточно высокой точностью интерпретировать существующие или получаемые экспериментальные данные.
Разработаны Программа и методики экспериментальных исследований для определения оптимальных значений параметров исследуемых ключевых процессов.
Разработаны эскизные конструкторские документации на испытательные (лабораторные) стенды, которые позволяют перейти к изготовлению испытательных (лабораторных) стендов и проведению на них экспериментальных исследований.
На средства индустриального партнера, ЗАО «Компания «ЭКОС», проведены предусмотренные проектом работы:
— Проведено инженерно-техническое обследование на местах действующих полигонов ТБО и станций очистки сточных вод.
— Обоснована целесообразность совместной анаэробной обработки органической фракции ТБО и ОСВ с получением метана.
— Разработана эскизная конструкторская документация на образец комплексной экспериментальной установки, включающей анаэробный биореактор, систему механического и физико-химического сгущения осадка, и реакторов частичной нитрификации и анаммокс. Проведено материально-техническое обеспечение работ.
— Принято участие в мероприятиях, направленных на освещение и популяризацию промежуточных результатов работы.

V

На этапе III в период с 1 июля 2015 г. по 31 декабря 2015 г. выполнены следующие основные работы:

Разработаны и изготовлены испытательные (лабораторные) стенды для проведения экспериментальных исследований на модельных субстратах и реальном сырье.

Проведены экспериментальные исследования процессов анаэробного сбраживания ОФ-ТБО метаногенными микробными сообществами, частичной нитрификации и анаммокс на испытательных (лабораторных) стендах по разработанным Программе и методикам.  В результате проведенных исследований показано, что ко-ферментация ОСВ и ОФ-ТБО происходит стабильно даже при предельно высокой нагрузке по органическому веществу и по сравнению со сбраживанием  ОСВ позволяет увеличить скорость и  выход биогаза до трех раз. Подобрана оптимальная концентрация флоккулянта для эффективного обезвоживания сброженной массы и отделения иловой воды. В реакторах частичной нитрификации-анаммокс удаляется  до 85%  азота из минеральной среды и иловой воды анаэробного биогазового реактора. Полученные результаты позволяют перейти к обобщению и интерпретации результатов экспериментальных исследований, корректировке базовой математической модели и разработке документации на микробные сообщества и микробиологические процессы.

На средства индустриального партнера, АО «Компания «ЭКОС», проведены предусмотренные проектом работы:
Разработана экспериментальная установка, состоящая из гомогенизатора ОФ-ТБО, биогазового реактора, системы механического и физико-химического сгущения сброженного осадка и отделения иловой воды, а также реакторов частичной нитрификации и анаммокс с иммобилизацией активного ила путем ершовой загрузки.
Проведено материально-техническое обеспечение работ по разработке экспериментальной установки.

V

Основные результаты 4 этапа выполнения проекта:

За счет средств субсидии:
1. Проведена обработка, обобщение и интерпретация результатов экспериментальных исследований
2. Проведено сопоставление результатов теоретических и экспериментальных исследований.
3. Выполнена проверка и корректировка базовой математической модели.
4. Разработана документация на микробные сообщества и микробиологические процессы.

За счет внебюджетных средств:
5. Проведены гидравлические испытания и пуско-наладочные работы на комплексной экспериментальной установке.
6. Выполнена инокуляция биореакторов комплексной экспериментальной установки.
7. Руководитель и исполнители проекта на четвертом этапе выполнения проекта приняли участие в 2-х мероприятиях, направленных на освещение и популяризацию промежуточных результатов работы. Высокий уровень представленных работ подтверждается двумя дипломами и золотой медалью за лучшую работу.

V

На 5 (заключительном) этапе проекта выполнены следующие виды работ:

  1. Проведена обработка, обобщение и интерпретация результатов экспериментальных исследований, которая показала, что  ко-ферментация ОСВ и ОФ-ТБО позволяет увеличить скорость образования биогаза в 2.5-2.7 раз, по сравнению со сбраживанием  в реакторе только ОСВ.
  2. Проведена проверка и корректировка базовой математической модели ко-ферментации ОСВ и ОФ-ТБО на основе сравнения расчетных и экспериментальных данных. В экспериментах выход биогаза от расчётного составлял от 71% (при использовании только ОСВ) и повышается с увеличением доли ОФ-ТБО в смеси с ОСВ до 83%. Близкие значения экспериментального и расчётного выхода биогаза свидетельствуют о правильной оценке состава субстрата и степени его разложения в реакторе.
  3. Успешно проведены гидравлические испытания, пуско-наладочные работы  и инокуляция биореакторов на комплексной полностью автоматизированной экспериментальной установке с емкостью  в биогазового реактора 200 л.
  4. Разработан лабораторный регламент технологического процесса  ко-ферментации ОСВ и ОФ-ТБО.
  5. Эффективность удаления аммонийного азота из иловой воды в системе последовательно соединенных реакторов частичной нитрификации и анаммокс при температуре 30оС  достигла в среднем 73%.
  6. Проведено технико-экономическое обоснование разработанной  технологии.
  7. Проведены маркетинговые исследования с целью изучения перспектив коммерциализации РИД и разработаны рекомендации по использованию результатов ПНИ в реальном секторе экономики, а также в дальнейших исследованиях и разработках.
  8. Разработан проект технического задания на проведение ОКР по теме: «Разработка экспериментальной установки полного цикла анаэробной переработки органической фракции твердых бытовых отходов (ТБО)».


Проекты, выполняемые Институтом Биоинженерия, в рамках
ФЦП«Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2014-2020 годы»

Проект: Создание биокатализатора на основе новой рекомбинантной синтазы цефалоспоринов-кислот для синтеза цефалоспориновых антибиотиков
Номер проекта: 14.604.21.0022
Мероприятие ФЦП: 1.2
Руководитель работ: Эльдаров Михаил Анатольевич
Сроки выполнения: 2014-2015 гг.
Общий объем бюджетного и привлеченного финансирования: 10,52 млн. руб. 

V

Цель — разработка метода синтеза цефалоспориновых антибиотиков с использованием биокатализатора на основе новой рекомбинантной синтазы цефалоспоринов-кислот.

Задачи проекта: Расшифровка последовательности генома штамма E. Coli CZ-08 – продуцента синтетазы цефалоспоринов-кислот (CASA), идентификация гена CASA, создание эффективных штаммов-продуцентов CASA, создание гетерогенного технологического биокатализатора на основе рекомбинантной CASA, разработка метода синтеза цефазолина с использованием биокатализатора на основе рекомбинантной CASA. 

V

  1. Проведен подробный анализ научной и патентной литературы по проблемам ферментативного синтеза бета-лактамных антибиотиков, в том числе класса цефалоспоринов-кислот, получению рекомбинантных ферментов для синтеза цефалоспориновых антибиотиков, их аналогов с использованием методов молекулярного моделирования и белковой инженерии, создания биокатализаторов на их основе.
  2. Методами высокопроизводительного секвенирования расшифрован геном штамма E.coli CZ-08, ген CASA идентифицирован как гомолог гена PGA.
  3. Ген CASA выделен, клонирован в оригинальный вектор экспрессии, получен эффективный штамм-продуцент CASA.
  4. На основании предварительного анализа информационных источников, на примере пенициллин G ацилазы (PGA), выявлены некоторые проблемы в создании эффективных рекомбинантных штаммов-продуцентов нативных и мутантных форм PGA, заключающиеся в подборе условий культивирования штамма E.coli – реципиента, метода экстракции из биомассы штамма E.coli функционально-активной PGA, иммобилизации PGA на различных носителях.
  5. Проведены патентные исследования, направленные на выявление патентных и не патентных источников информации, посвященных различным аспектам ферментативного синтеза цефалоспориновых антибиотиков, использованию современных достижений биотехнологии, энзимологии, генетической и белковой инженерии для создания более эффективных промышленных биокатализаторов для получения антибиотиков класса цефалоспоринов-кислот.
  6. Разработана аналитическая методика определения ферментативной активности CASA, позволяющая характеризовать по синтетазной активности биомассу клеток рекомбинантного штамма, получаемые из нее ферментные препараты разной степени очистки и гетерогенный биокатализатор на основе CASA.
  7. Разработана аналитическая методика контроля процесса биокаталитического синтеза цефазолина с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии, позволяющая проводить операционные испытания технологического биокатализатора на основе CASA с целью определения таких технологических характеристик как максимальная степень превращения бета-лактам-содержащего субстрата в цефазолин и период полуинактивации БК, а также осуществлять динамический контроль процесса синтеза по обоим субстратам, целевому и побочному продуктам ферментативной реакции для исследовательских целей.
  8. Привлечены внебюджетные средства в объеме 450 000 рублей, израсходованные на ремонт и закупку технологического оборудования, проведение патентных исследований, биоинформационный анализ последовательностей генома штамма E.coli CZ-08.


Проект: Молекулярная диагностика бактериальных и вирусных фитопатогенов винограда, актуальных для сельского хозяйства Крыма
Номер проекта: 14.604.21.0145
Мероприятие ФЦП: 1.2
Руководитель работ: Игнатов Александр Николаевич
Сроки выполнения: 2014-2016 гг.
Общий объем бюджетного и привлеченного финансирования: 22,25 млн. руб

V

Целью проекта является комплексный анализ генетического разнообразия и распространенности на территории Крымского полуострова вирусных и бактериальных фитопатогенов для разработки прототипов диагностических наборов, основанных на современных инструментальных методах.

V

За счет средств субсидии:

  1. Проведен аналитический обзор информационных источников по теме проекта. Список использованных источников содержит 46 наименований, 30 из них — за период 2009 – 2013 гг.
  2. Обоснованы и выбраны направления исследований.
  3. Проведены патентные исследования.
  4. Проведено обследование виноградников на наличие растений с внешними признаками поражения вирусными и бактериальными инфекциями.

За счет внебюджетных источников:

Проведены маркетинговые исследования рынка тест-наборов для диагностики фитопатогенных вирусов и бактерий и средств химической защиты растений для снижения вредоносности вирусов и бактерий на винограде и других древесных культурах.